響應面法優化白果蛋白質提取工藝

張秀云，李丹丹，馬艷芳（.萊蕪職業技術學院信息工程系，山東萊蕪700；.菏澤市食品藥品監督管理局，山東菏澤74000；.山東農業大學生命科學學院，山東泰安708）

響應面法優化白果蛋白質提取工藝

張秀云1，李丹丹2，馬艷芳3
（1.萊蕪職業技術學院信息工程系，山東萊蕪271100；2.菏澤市食品藥品監督管理局，山東菏澤274000；3.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018）

以白果為原料，在單因素實驗的基礎上采用響應面分析法研究白果蛋白質的提取工藝，考察提取液濃度、pH、料液比及提取時間對白果蛋白質提取率的影響。結果表明白果提取蛋白質的最適條件為：提取液濃度0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，此條件下，白果蛋白質的提取率為82.76%，與理論預測值83.01%相比，其相對誤差為0.30%，說明優化得出的回歸模型具有一定的實際指導意義。

白果蛋白質，提取，響應面法

白果，又名銀杏，是銀杏的種仁，具有可食性［1］。研究表明，白果內營養成分豐富，主要有淀粉、蛋白質、脂肪、維生素、尼克酸以及鉀、鈣、鎂等多種微量元素等［2］。此外銀杏酸、白果酚、膽固醇等功效成分亦成為白果的一大研究熱點［3］。因此，白果廣泛應用于食品、藥品、保健品、化妝品等領域。

白果中含有8%～13%的蛋白質，因地域不同含量有所差異。研究顯示，作為一種新型的植物蛋白，白果蛋白質氨基酸組成豐富合理，屬于優質蛋白質，并具有良好的抗氧化和延緩衰老的作用［4-5］。此外，白果蛋白對食品的加工性能、營養和口感有一定的影響，其持油性、持水性和起泡性奠定了其在食品領域的應用基礎［6］。但現今對白果蛋白的研究尚處于一個初步探索階段，對其實際應用方面的研究還很匱乏。因此，提取白果蛋白質并進行深入研究對擴大其應用范圍、充分發揮其生物功效有重要意義。目前對白果蛋白質的提取多采用傳統提取法和正交優化實驗，但是提取率不是很高［7-8］。因此為了獲得高提取率的白果蛋白和充分利用原料，本文采用響應面分析法對白果蛋白質的提取工藝進行優化，得到白果蛋白質的最佳提取條件，為今后白果蛋白的大規模生產和其產品的深加工提供了可行性依據，對白果的綜合利用及新產品開發提供基礎研究資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白果郯城縣匯豐食品有限責任公司；牛血清蛋白質南京三生生物技術有限公司；考馬斯亮藍G250上海綠鳥科技發展公司；氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、石油醚（均為分析純） 天津市博迪化工有限公司。

K9860全自動凱氏定氮儀濟南海能儀器有限公司；MP511 pH計上海精密儀器；TU180紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；臺式高速離心機上海盧湘儀器有限公司；高速組織粉碎機金壇市萬華實驗儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1白果蛋白提取工藝流程白果→脫種皮和胚芽→干燥（60℃）→粉碎過篩（60目）→石油醚脫脂→干燥（60℃）→提取（Tris-HCl法）→離心15 min→定容→含量測定。

1.2.2白果蛋白質的提取及測定采用Tris-HCl提取法提取白果蛋白質。采用凱氏定氮法測定脫脂白果粉中的總蛋白質含量，參照GB 5009.5-2010；采用考馬斯亮藍法測定白果提取液中蛋白質的含量，參照文獻［9-10］；白果蛋白質提取率的計算公式為：

白果蛋白質提取率（%）=提取液中蛋白質含量/原料中蛋白質含量×100

1.2.3提取白果蛋白質的單因素實驗選取提取液濃度、pH、料液比及提取時間四個因素進行單因素實驗。固定pH8.0、料液比1∶25、提取時間6 h，提取液Tris-HCl濃度選取0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L；固定提取液濃度0.2 mol/L、料液比1∶25、提取時間6 h，提取液pH采用4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六個水平；固定提取液濃度0.2 mol/L、pH8.0、提取時間6 h，料液比采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）6個水平；固定提取液濃度0.2 mol/L、pH8.0、料液比1∶25；提取時間采用2、4、6、8、10、12 h六個水平，分別進行單因素實驗。

1.2.4響應面法提取白果蛋白質工藝研究在上述單因素實驗的基礎上，對提取液濃度、pH、料液比及提取時間四個實驗進行了Box-Behnken實驗設計，進行響應面分析，優化工藝條件。實驗因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken實驗設計因素與水平值Table 1　Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5數據處理方法用Excel和Design-Expert 6.0軟件進行實驗數據的圖表和數據分析。用Box-Behnken組合進行提取工藝優化。

2　結果與分析

2.1白果蛋白質含量測定結果

凱氏定氮法測定白果中的蛋白質含量為10.27%，含水量7.21%。

2.2提取白果蛋白質的單因素實驗

2.2.1提取液濃度對白果蛋白質提取率的影響由圖1可見，在Tris-HCl濃度為0.1～0.2 mol/L的范圍內隨著Tris-HCl濃度的提高，蛋白質提取率不斷升高，當Tris-HCl濃度為0.2 mol/L時，白果蛋白質的提取率達到最高。繼續增加提取液濃度，蛋白質提取率不斷下降。可能是進一步提高濃度時，離子的水合作用，降低了蛋白質的溶解度［11］，從蛋白質提取率及節約溶質用量兩方面考慮，選擇0.2 mol/L的Tris-HCl溶液為白果蛋白質的提取液。

圖1　提取液濃度對白果蛋白質提取率的影響Fig.1　Effect of Tris-HCl concentration on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.2pH對白果蛋白質提取率的影響由圖2可知，當提取液pH由pH4.0逐步升高到pH9.0時，白果蛋白質提取率也逐漸增大，尤其在pH4.0～8.0之間規律更為明顯，但當繼續增大pH，提取率增大不明顯。這是因為堿性條件可以會打破蛋白質分子間的部分氫鍵［12］，從而促使淀粉和蛋白質分離，增加了蛋白提取率。但是，過堿性環境會使蛋白質發生變性或水解，可能會影響蛋白質的活性，因此提取白果蛋白質的提取液pH應控制在pH8.0左右。

圖2　pH對白果蛋白質提取率的影響Fig.2　Effect of pH on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.3料液比對白果蛋白質提取率的影響圖3反映了料液比對蛋白質提取率的影響，圖中曲線顯示了蛋白質提取率隨料液比的變化而變化，隨著溶劑量的增大，蛋白質提取率隨之增大。當水料比為1∶35時，蛋白質提取率達到最大值，但是由圖可知在水料比由1∶30變為1∶35時，蛋白質提取率的變化曲線走勢平緩。由于過高的水料比會產生大量的廢液，增大成本，所以最終將料液比定為1∶30。

圖3　料液比對白果蛋白質提取率的影響Fig.3　Effect of the solid-liquid rate on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.4提取時間對白果蛋白質提取率的影響由圖4看出，提取時間在6 h時，蛋白質提取率達到最高水平，其后隨著提取時間的進一步增加，蛋白質提取率下降，但下降幅度不大，在6～12 h的區間內，提取率從46.63%下降到36.02%，下降了10.41%。分析原因：給予白果粉充足的溶脹時間，有利于蛋白質的分離溶解［13］，但若提取時間過長，則可能有部分蛋白質出現凝聚沉淀，與不溶物質一起在離心時除去了，而且時間加長也會加大生產成本，所以綜合各方面因素，認為浸提時間選4 h比較合適。

圖4　提取時間對白果蛋白質提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on the extraction rate of Ginkgo protein

2.3響應面法實驗結果

在單因素實驗的基礎上，進行了響應面優化實驗，其實驗設計及結果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對表2響應面分析結果進行回歸分析，對提取液濃度（A）、pH（B）、料液比（C）及提取時間（D）等四個因素進行回歸擬合，得到回歸方程為：Y=80.15+3.53A+4.48B+2.77C+1.78D-0.69A2-2.40B2-0.58C2-0.97D2-4.30AB-2.72AC-3.13AD-1.44BC+0.70BD-1.14CD

對該實驗模型的顯著性分析見方差分析表3。模型F=16.91，Pr＞F值＜0.0001表明此回歸模型是極顯著的。有0.01%的可能是因外界環境的干擾而發生變化。A、B、C、D、B2、AB、AC、AD的Pr＞F值均小于0.05，說明這些是顯著的模擬項。失擬項F=0.71，Pr＞F= 0.9999＞0.05表明失擬項相對于純誤差不顯著，且無失擬因素存在，回歸方程擬合充分，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

各因素的F值大小可以反映因素對實驗指標的重要性，F值越大表明對實驗指標的影響越大［14］。由表3可知，F（A）=49.27，F（B）=79.39，F（C）=30.33，F（D）=12.58，且F（B）＞F（A）＞F（C）＞F（D），即各因素對白果蛋白提取率的影響順序為：pH＞提取液濃度＞料液比＞提取時間。

回歸方程中各因素系數的絕對值大小反應了其對響應值的影響程度，系數的正、負反應影響的方向［15］。因為本方程的二次項系數是負值，代表3D圖形拋物面開口向下，有極大值，因此可以進行優化分析［16］。

表2　Box-Behnken實驗設計與結果Table 2　Box-Behnken experiment design and the results of these experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of the regression model

利用Design Expert軟件做不同因素間的響應面分析圖和等高線圖。該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白質提取率的影響。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素間交互作用較強，圓形則相反［17-18］。具體結果及分析見圖5～圖7所示。

圖5　提取液濃度和pH的交互作用Fig.5　The interaction of Tris-HCl concentration and pH

圖5表明，提取液濃度和pH的交互作用對白果蛋白質的提取率有顯著影響。圖中曲線顯示，當料液比和提取時間一定時，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質提取率逐漸增大且趨于平緩，隨著pH的增大，白果蛋白質提取率先增大隨后保持平緩的變化趨勢。提取液濃度和pH兩因素對白果蛋白質提取率交互作用顯著。

圖6　提取液濃度和料液比的交互作用Fig.6　The interaction of Tris-HCl concentration and solid-liquid rate

圖6表明，當pH和提取時間一定時，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質提取率先增大隨后趨于平緩，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質提取率先增大隨后有減小的趨勢。隨著料液比的增大，白果蛋白質提取率先增大隨后趨于平緩。因此，提取液濃度和料液比兩因素對白果蛋白質的提取率影響顯著。

圖7表明，當pH和料液比一定時，增大提取液濃度白果蛋白質提取率也隨之增大，達到最大之后趨于平緩，隨著提取時間的延長，白果蛋白質提取率先增大隨后保持平緩的變化趨勢。因此，pH和料液比的交互作用對白果蛋白質提取率具有顯著影響。

圖7　提取液濃度和提取時間的交互作用Fig.7　The interaction of Tris-HCl concentration and extraction time

2.4驗證實驗

經軟件分析優化，由該模型得到的最佳優化條件為：提取液濃度為0.158 mol/L，pH8.67，料液比1∶25.78，提取時間5.15 h，且預測白果蛋白質提取的理論值為83.01%。考慮到實際操作性，將實驗條件修正為：提取液濃度為0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，在此修正條件下進行三次提取實驗，蛋白質提取率的平均值為82.76%，與理論值較為接近，表明數學模型對優化白果蛋白質的提取工藝是可行的。與李瑩瑩等［7］采用正交實驗優化白果蛋白質提取率75.01%相比，響應面分析法提取具有較高的提取率。

3　結論

利用響應面分析法建立的數學模型方差分析說明模型顯著擬合度好，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。利用實驗模型進行響應面分析，對實驗因素及其相互作用進行探討，優化提取白果蛋白質的最佳提取工藝條件為：0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，且此條件下蛋白質提取率的平均值為82.76%，與理論值較為接近，表明數學模型對優化白果蛋白質的提取工藝是可行的。

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Optimization of Ginkgo protein extraction by response surface methology

ZHANG Xiu-yun1，LI Dan-dan2，MA Yan-fang3
（1.Department of Information Engineering，Laiwu Vocational and Technical College，Laiwu 271100，China；2.Heze Food and Drug Administration，Heze 274000，China；3.College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

The response surface analysis method was used to study the Ginkgo protein extraction process on the basis of single factor experiment with Ginkgo for materials，the effect of Tris-HCl concentration，pH，solidliquid rate，extraction time on the protein extraction yield was inspected.The research results showed that the optimal conditions for ginkgo protein extraction：0.16 mol/L，pH8.7，1∶26（g/mL），and 5 h.Under this condition，the yield of Ginkgo protein was 82.76%，compared to the theoretical value，the relative error of 0.30%.Optimized regression equation derived some practical significance.

Ginkgo protein；extraction；response surface method

TS251.1

B

1002-0306（2016）04-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.051

2015－07－24

張秀云（1980-），女，碩士，講師，主要從事食品生物技術方面的研究，E-mail：zhangxiuyun1980@126.com.。