納米氧化鋅對甜瓜主要致病菌抑菌活性研究

王虎軍，路　軍，薛華麗，，*，趙　軍，*，畢　陽，南米娜（.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州70070；2.甘肅農業大學農業資源化學與應用研究所，甘肅蘭州70070；.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州70070）

納米氧化鋅對甜瓜主要致病菌抑菌活性研究

王虎軍1，2，路軍1，薛華麗1，2，3，*，趙軍1，*，畢陽3，南米娜1，2
（1.甘肅農業大學理學院，甘肅蘭州730070；
2.甘肅農業大學農業資源化學與應用研究所，甘肅蘭州730070；
3.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

為研究納米氧化鋅對引起采后甜瓜粉霉病、白霉病和黑斑病的主要致病菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）、鐮刀菌（Fusarium spp.）、交鏈孢（Alternaria）的抑制效果，本文通過不同濃度的固相和液相納米氧化鋅對粉紅單端孢（T.roseum）、硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）、互隔交鏈孢（Alternaria alternate）三種菌分別進行體外、體內抑菌活性實驗研究。體外實驗結果表明：固相和液相納米氧化鋅對這三種病原菌菌絲生長、孢子萌發均具有明顯的抑制作用，且隨著溶液濃度的增大，抑制效果增強；固相納米氧化鋅較液相具有更佳的抑菌效果，且對T.roseum的抑制作用最強，其次是F.sulphureum、A.alternate。體內實驗結果表明，固相和液相納米氧化鋅處理均可顯著抑制由T.roseum、F.sulphureum、A.alternate損傷接種甜瓜果實病斑直徑的擴展。故兩種性狀納米氧化鋅均可通過抑制甜瓜采后主要致病菌的生長來減輕甜瓜采后病害，且固相納米氧化鋅較液相納米氧化鋅效果更為明顯。

納米氧化鋅，T.roseum，F.sulphureum，A.alternate，抑菌

甜瓜是我國西北地區一種重要的經濟作物，因其外形美觀，風味獨特，而深受廣大消費者喜愛［1-2］。但由于其成熟期相對集中，且正處于高溫季節，加之缺乏有效的冷鏈設施，采后病害頗為嚴重［3］。甜瓜采后的病害與多種病原菌有關，其中由T.roseum、Fusarium spp.、Alternaria分別引起的粉霉病、白霉病、黑斑病是甜瓜腐爛損失的重要原因［4-5］。化學殺菌劑雖然可有效控制甜瓜采后病害的發生，但由于藥物殘留、環境污染以及誘導病原物產生抗藥性等問題而使其使用受到了限制，故新型抑菌劑的研究已成為一種必然趨勢［6］。

氧化鋅具有良好的熱穩定性、持久性，且作為人體所必需的微量元素，與人體相容性好等獨特性質，使之成為良好的無機抑菌材料［7］。納米氧化鋅又稱為超微細氧化鋅，因其顆粒大小處于納米級別、比表面積大，故納米氧化鋅的生物活性較其本體得到很大提升，越來越受到人們的青睞［8］。目前，關于納米氧化鋅的抑菌作用研究主要集中在細菌方面，朱志宏等［9］研究表明，液相納米氧化鋅對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有良好的抑制效果。高艷玲等［10］研究證實，納米氧化鋅對枯草芽孢桿菌的抑制能力最強，其次是傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，然而對李氏桿菌沒有抑制作用。劉瑾瑾等［11］研究發現，納米氧化鋅可直接抑制由A.alternate和P.expansum引起的蘋果黑斑病、青霉病。但目前有關納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate真菌的抑制作用研究未見報道，且不同性狀納米氧化鋅的抑菌作用存在差異。為此，本文以不同性狀、不同濃度的納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum和A.alternate的抑菌效果進行研究，以期為甜瓜采后病害的控制提供一定的理論參考。

1　材料及方法

1.1材料及儀器

白雪公主甜瓜2015年4月購于蘭州市安寧區鋁廠果蔬市場，選擇大小均勻、外觀無損傷的果實，單個套袋紙箱包裝后運抵本校實驗室，室溫（20±2）℃貯藏待用；粉紅單端孢（Trichothecium roseum）、硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）、互隔交鏈孢（Alternaria alternate）均由甘肅省農業科學研究院提供；納米氧化鋅由甘肅農業大學理學院提供，固相納米氧化鋅以七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）和氯化鈉（NaCl）（質量比為1∶2），氫氧化鈉為原料采用固相研磨法一步合成，并經X射線衍射（XRD）、透射電鏡（TEM）、紅外光譜（IR）進行表征測定，平均粒徑為20 nm；液相納米氧化鋅以碳酸鈉（NaCO3）和七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）（體積比為1∶1）為原料采用直接沉淀法制備，并經X射線衍射（XRD）、透射電鏡（TEM）、紅外光譜（IR）進行表征測定，平均粒徑為30 nm；噻唑藍（純度＞98.0%） 購于上海源聚生物科技有限公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；VXH-3型微型漩渦混合器上海躍進醫療器械廠；CX21FS1C型生物顯微鏡鏡奧林巴斯（廣州）工業有限公司；DHP-9272B型恒溫培養箱上海一恒科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1孢子懸浮液的制備根據劉瑾瑾等［11］的方法并修改。將實驗菌于PDA培養基中25℃下活化7 d，然后取帶菌PDA平皿一個，加入無菌水約10 mL，用無菌的玻璃涂布器刮下平板上的實驗菌孢子，以無菌雙層紗布過濾至50 mL無菌小燒杯中，濾液用血球計數板計數，計算出孢子懸浮液的濃度，然后稀釋至所需濃度（1×106孢子/mL）。

1.2.2最低抑菌濃度（MIC）的測定根據Li等［12］方法并略做修改，將96孔培養板紫外照射10 min，然后向每孔中加入100 μL無瓊脂察氏培養基，于第1列加入100 μL的納米氧化鋅，混勻后吸出100 μL置于第2列，依次稀釋至第10列，第10列混勻后吸出100 μL棄去；然后每孔加入20 μL的菌懸液，各濃度設3個平行，最后一列作為對照加入無菌水。最后于各孔加入20 μL 0.5 mg/mL的噻唑藍指示劑，蓋好培養板并在25℃培養24～48 h，觀察指示劑顏色變化，并記錄最低抑菌濃度。以上操作均在無菌條件下進行，所用試劑及器材均已滅菌。

1.2.3納米氧化鋅處理對菌絲生長的影響根據He等［13］方法并略作修改，先將納米氧化鋅分別置于150 mL PDA培養基中，使其終濃度為MIC的1、2、4倍，以不添加納米氧化鋅作為對照，混合均勻經滅菌后分別倒入90 mm培養皿中，待培養基冷卻凝固后，接種T.roseum、F.sulphureum、A.alternate病原菌菌餅（直徑10 mm），25℃避光恒溫培養，3 d后十字交叉法測定其菌落直徑并記錄，每個處理平行3次。抑菌率的計算如下：

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-原菌餅直徑）×100

1.2.4納米氧化鋅處理對孢子萌發的影響根據劉瑾瑾等［11］方法并略作修改，用無菌打孔器打取直徑為10 mm的2%瓊脂培養基，用無菌鑷子將其置于滅菌的載玻片上，將載玻片置于已滅菌且裝有濕潤濾紙的培養皿中，然后分別滴加20 μL納米氧化鋅溶液于培養基上，所加納米氧化鋅濃度分別為MIC的5、25、125倍，以加入同體積無菌水作為對照，再在其上加入20 μL孢子懸浮液，蓋上蓋玻片。25℃下連續鏡檢數小時，直到對照基本完全萌發。每次鏡檢至少200個孢子，重復3次。

1.2.5納米氧化鋅處理對甜瓜病斑直徑的影響依據畢陽等［14］方法并修改。選擇大小均一的無病蟲害甜瓜果實，用清水進行清洗，然后以2%NaClO液浸泡消毒4 min，待晾干后用70%酒精表面消毒，再用無菌打孔器（深度8 mm，直徑2 mm）在赤道部位均勻打取4個孔，待孔內汁液晾干后，分別向孔內注射1×106個/mL的孢子懸浮液20 μL，3 h后再分別在納米氧化鋅溶液中浸泡3 min，液相納米氧化鋅濃度為3.00、6.00、9.00 mg/mL；固相納米氧化鋅濃度為0.30、0.60、0.90 mg/mL，以無菌水處理為對照，甜瓜處理之后用PE薄膜包裹，在（20±2）℃下貯藏，待明顯發病后測量病斑直徑。

1.3數據處理

數據處理采用Excel 2013和SPASS 19.0統計軟件進行鄧肯氏多重差異分析（p＜0.05）。

2　結果與分析

2.1最低抑菌濃度

納米氧化鋅對各實驗菌的最低抑菌濃度（MIC）值如表1所示。由此可知，兩種性狀的納米氧化鋅對T.roseum，F.sulphureum，A.alternate均具有抑制活性。同時，固相納米氧化鋅對這三種病原菌的抑菌效果優于液相納米氧化鋅，如：對T.roseum、F.sulphureum的抑制作用中，固相納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum的最低抑菌濃度均為液相納米氧化鋅的6.7倍，而A.alternate的抑制作用中，固相納米氧化鋅是液相納米氧化鋅的7.5倍。

此外，兩種納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum的抑菌效果均優于A.alternate，如液相納米氧化鋅對A.alternate的最低抑菌濃度均為T.roseum、F.sulphureum 的3倍，固相納米氧化鋅對A.alternate的最低抑菌濃度均為T.roseum、F.sulphureum的2.7倍。由于抑菌濃度越低，表明抑菌效果越好，故兩種納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum抑制效果均強于對A.alternate的抑制效果。

表1　納米氧化鋅對各實驗菌種的MIC值Table 1　The MIC value of nano-ZnO against fungus

2.2納米氧化鋅對菌絲生長的影響

由表2可知：無論固相、還是液相納米氧化鋅，其對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate均具有抑制效果；對于液相納米氧化鋅，在0.00～0.80 mg/mL范圍內，隨著納米氧化鋅濃度的增加，這三種菌的菌絲生長抑制率亦呈現相應上升的趨勢。在0.00～0.20 mg/mL范圍內，T.roseum抑制率的上升趨勢較F.sulphureum明顯，之后趨勢又趨向平緩；當濃度為0.20 mg/mL時，T.roseum的抑制率為55.6%，明顯的高于F.sulphureum的抑制率31.4%；所以液相納米氧化鋅對T.roseum的抑制作用強于F.sulphureum。

對于固相納米氧化鋅，在0.00～0.12 mg/mL的范圍內，對T.roseum與F.sulphureum呈現明顯的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制率也相應增大；在0.00～0.32 mg/mL范圍內，對A.alternate的抑制率也隨著濃度的增加呈上升趨勢。在0.00～0.03 mg/mL范圍內，對T.roseum與F.sulphureum抑制率上升趨勢都較為顯著，A.alternate趨勢相對平緩，故T.roseum和F.sulphureum對納米氧化鋅較A.alternate敏感，當納米氧化鋅濃度為0.03 mg/mL時，T.roseum的抑制率為28.0%，高于F.sulphureum的20.6%，故T.roseum較F.sulphureum更為敏感。

2.3納米氧化鋅對孢子萌發的影響

據表3可知，納米氧化鋅對孢子的萌發具有明顯的抑制作用。當濃度為1.00 mg/mL和5.00 mg/mL的液相納米氧化鋅分別處理T.roseum、F.sulphureum時，T.roseum的孢子萌發率分別為對照的76.5%、70.7%，F.sulphureum的孢子萌發率分別為對照的76.6%、72.1%，這兩種濃度處理對T.roseum、F.sulphureum的孢子萌發率影響并不是很明顯；但當濃度為25.00 mg/mL時，T.roseum孢子萌發率僅為對照的51.3%，F.sulphureum孢子萌發率僅為對照的54.4%，該濃度下表現出顯著的影響。同樣，濃度為3.00 mg/mL 和15.00 mg/mL的液相納米氧化鋅處理A.alternate的孢子時，其萌發率分別為對照的81.0%、79.9%，對其孢子萌發率的影響并不顯著。而當濃度為75.00 mg/mL時，對A.alternate的萌發率為對照的62.5%。

表2　納米氧化鋅對T.roseum，F.sulphureum，A.alternate菌絲生長影響Table 2　Effect of zinc oxide nanoparticles on mycelial growth of T.roseum，F.sulphureum，A.alternate

表3　納米氧化鋅對T.roseum，F.sulphureum，A.alternate孢子萌發的影響Table 3　Effect of zinc oxide nanoparticles on spore germination of T.roseum，F.sulphureum，A.alternate

固相納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum的孢子萌發率實驗中，濃度為0.03 mg/mL時，對T.roseum、F.sulphureum孢子萌發率的影響不是太明顯，而當濃度為0.80 mg/mL時這兩種菌的孢子萌發率分別是對照的63.7%和69.2%。對A.alternate孢子萌發率的影響中，濃度為0.08、0.40 mg/mL時對孢子萌發率的影響不顯著，然而當濃度為2.00 mg/mL時，其孢子萌發率是對照的65.9%。

2.4納米氧化鋅對甜瓜病斑直徑的影響

由表4可知，納米氧化鋅對損傷接種T.roseum、F.sulphureum和A.alternate的甜瓜病斑直徑均具有一定的抑制作用。如第11 d時，濃度為3.00、6.00、9.00 mg/mL的液相納米氧化鋅處理由T.roseum損傷接種甜瓜果實時，其病斑直徑分別為對照的71.7%、69.8%、67.9%。而液相納米氧化鋅對損傷接種F.sulphureum甜瓜果實的12 d病斑直徑的影響中，濃度為3.00、6.00、9.00 mg/mL時分別是對照的85.3%、80.0%、72.0%。值得注意的是，濃度為3.00 mg/mL和6.00 mg/mL液相納米氧化鋅對損傷接種A.alternate甜瓜果實病害的抑制率表現出較好的抑制效果，然而當濃度增大為9.00 mg/mL，病斑直徑反而增大，與對照之間無顯著差異；另隨著時間的增長，納米氧化鋅的作用呈現減弱趨勢，如在第12 d時損傷接種F.sulphureum甜瓜病斑出現重疊，故三種菌的測定終點分別為13、12、30 d。

固相納米氧化鋅對損傷接種T.roseum甜瓜果實的9 d病斑直徑影響中，濃度為0.30、0.60、0.90 mg/mL時，甜瓜病斑直徑分別為對照的88.6%、86.4%、61.4%。而0.30、0.60、0.90 mg/mL的固相納米氧化鋅處理F.sulphureum損傷接種11 d的甜瓜果實時，病斑直徑分別是對照的92.8%、85.5%、76.8%。而當濃度為0.30 mg/mL和0.60 mg/mL固相納米氧化鋅對損傷接種A.alternate甜瓜果實病害的抑制率表現出較好的抑制效果，然而，當濃度增大為0.90 mg/mL時病斑直徑反而增大，與對照之間差異不顯著。

3　討論

體外實驗中，納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate均具有明顯的抑制作用，且在一定濃度范圍內，隨著納米氧化鋅濃度的增大，其抑制效果增強。這與何臨海等［15］報道結果類似，該報道表明：不同質量濃度的納米氧化鋅懸濁液可顯著抑制白色念珠菌的生長，且在一定濃度范圍內，隨著濃度的增大抑菌效果增強。

固相納米氧化鋅較液相納米氧化鋅對所研究病原菌的抑制效果更強，其原因可能是固相納米氧化鋅較液相納米氧化鋅顆粒小、粒度均勻，故比表面積亦相應較大，進而與實驗菌的接觸面積較大，產生的活性氧更易抵達實驗菌表面，引起實驗菌細胞膜的滲漏及細胞內大分子物質的變性，這與呂中等［7］研究表明不同形貌的納米氧化鋅對金黃色葡萄球菌均有較好的抗菌活性，且棱柱狀的納米氧化鋅相對于其他兩個形貌的納米氧化鋅抗菌活性更強，朱志紅等［9］研究證實顆粒大小均勻、結晶性良好、晶型比較完整的納米氧化鋅具有良好的抑菌性能相一致。

同一狀態的納米氧化鋅對不同菌的抑制效果不同，其中對T.roseum的抑制效果最強，其次是F.sulphureum，最后為A.alternate。其原因：一方面可能是由于這三種菌對納米氧化鋅敏感程度不同，T.roseum對納米氧化鋅最為敏感，然后依次是F.sulphureum，A.alternate。如He等［15］研究發現P.expansum比Botrytis cinerea對納米氧化鋅更為敏感。另一方面可能是同一納米氧化鋅對這三種菌的抑制作用方式不同：對A.alternate，可能是納米氧化鋅引起了菌絲的變形，在變形的菌絲細胞中過度積累了核酸和糖，進而干擾細胞代謝，從而抑制了該菌的活性；對T.roseum、F.sulphureum可能是由于納米氧化鋅引起了活性氧（ROS）濃度的增大，活性氧（ROS）與細胞膜接觸并進入細胞，進而抑制病原菌的生長。He等［15］還發現納米氧化鋅主要是通過抑制分生孢子梗和分生孢子的生長來抑制P.expansum的

表4　納米氧化鋅對甜瓜病斑直徑的影響Table 4　Effect of zinc oxide nanoparticles on the melon disease spot diameter

生長，但納米氧化鋅對B.cinerea的影響主要是通過干擾細胞功能及影響菌絲變形來對其進行抑制；此外，Elumalai等［16］研究發現，納米氧化鋅對Candida albicans和Candida tropicalis的的抑菌作用與H2O2濃度相關，隨著納米氧化鋅濃度的增大，H2O2濃度在增大，其抑菌效果在增強。然而，關于納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate三種菌的作用機理仍需進一步探討研究。

體內實驗中，納米氧化鋅對由T.roseum、F.sulphureum、A.alternate分別引起的甜瓜粉霉病、白霉病、黑斑病均具有明顯的抑制作用，可能是因為納米氧化鋅直接抑制了T.roseum、F.sulphureum、A.alternate的孢子萌發，進而減緩了菌絲的生長，即納米氧化鋅對這三種病原菌的生長活性具有直接的抑制作用，最后導致粉霉病、白霉病、黑斑病病害的減輕，這與劉瑾瑾等［11］證實的納米氧化鋅對由A.alternate、P.expansum分別引起的蘋果黑斑病、青霉病有直接抑制作用相一致。

4　結論

兩種狀態納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate菌絲生長、孢子萌發均具有明顯的抑制作用，且在一定濃度范圍內隨著濃度的增大抑制作用增強。不同狀態的納米氧化鋅對T.roseum、F.sulphureum、A.alternate的抑制效果不同，其中固相納米氧化鋅較液相納米氧化鋅抑制效果強。同一狀態的納米氧化鋅對不同菌的抑制效果不同，其中對T.roseum的抑制效果最強，其次是F.sulphureum，最后為A.alternate。納米氧化鋅對損傷接種T.roseum，F.sulphureum，A.alternate甜瓜病斑直徑均具有明顯的抑制作用。

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The inhibitory effects of zinc oxide nanoparticles treatment on the important pathogenic fungi causing postharvest disease in muskmelon

WANG Hu-jun1，2，LU jun1，XUE Hua-li1，2，3，*，ZHAO Jun1，*，BI Yang3，NAN Mi-na1，2
（1.College of Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；3.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

To study the inhibitory effects of the zinc oxide nanoparticles on T.roseum，Fusarium spp.，Alternaria，which caused pink rot，Fusarium rot，black spot of postharvest muskmelon，respectively.The solid phase and liquid phase zinc oxide nanoparticles at different concentration and T.roseum，F.Sulphureum，A.alternate were used in vitro and vivo study.In vitro，the results showed that the significant inhibitory effect on mycelial growth and spore germination was found at different states of zinc oxide nanoparticles.The inhibition effect was greatly enhanced with the increase of the zinc oxide nanoparticles’s concentration.The inhibitory effect of the solid phase zinc oxide nanoparticles was more effective than the liquid phase one，which showed the most effect for T.roseum，then F.sulphureum，A.alternate.In vivo，it indicated that the solid phase and liquid phase zinc oxide nanoparticles had the significant inhibitory effect on the diameter of melon disease spot，which was caused by T.roseum，F.sulphureum，A.alternate，respectively.So zinc oxide nanoparticles could directly inhibit the major of pathogens to decrease disease of postharvest muskmelon，besides the inhibitory effect of solid phase zinc oxide nanoparticles was better than the liquid.

zinc oxide nanoparticles；Trichothecium roseum；Fusarium sulphureum；Alternaria alternate；antifungal

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0356-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.063

2015－05－26

王虎軍（1991-），男，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：feixuetiancan@sina.cn。

薛華麗（1977-），女，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：xuehuali77@sina.com。趙軍（1963-），女，碩士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：zhaojun63@gsau.edu.cn。

公益性行業（農業）科研專項（201303075）；甘肅省高等學校科研項目和甘肅農業大學伏羲人才青年基金項目。