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刺葡萄酒發酵過程中幾類多酚成分的含量變化分析

2016-09-16 06:35:05祝音潔郭思江李斯嶼
中國釀造 2016年3期

祝音潔,郭思江,李斯嶼,何 非*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院,葡萄與葡萄酒研究中心,北京 100083)

刺葡萄酒發酵過程中幾類多酚成分的含量變化分析

祝音潔,郭思江,李斯嶼,何非*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院,葡萄與葡萄酒研究中心,北京 100083)

該文以兩種湖南刺葡萄品種(米葡萄和甜葡萄)為原料釀造的干紅葡萄酒為研究對象,并利用高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)技術分析在其釀造過程中酚類物質的含量變化。結果顯示,在刺葡萄干紅葡萄酒樣品中共檢測到六大類酚類物質共33種,其中包括7種黃酮醇類物質、5種黃烷-3-醇類物質、3種羥基苯甲酸類物質、3種羥基肉桂酸類物質、7種非酰化花色苷類物質、8種酰化花色苷類物質。在整個釀造過程中,兩種刺葡萄酚類物質的變化基本一致,蘋乳發酵結束后酚類物質均明顯上升。其中米葡萄酒的黃酮醇、黃烷醇含量高于甜葡萄酒,而甜葡萄酒的其他四種酚類物質含量比米葡萄酒高。

刺葡萄;酚類物質;高效液相色譜-質譜聯用;酒精發酵;變化

刺葡萄(Vitis davidii)原產于中國,屬于東亞種群,是我國特色野生葡萄種之一,主要生長在我國長江南岸亞熱帶雨林地區[1]。因其莖上布滿了1~2mm的小刺,貌似荊棘,因此得名刺葡萄。我國湖南省人工栽培刺葡萄已有200多年的歷史,目前種植面積已達6 800 hm2,主要分布在雪峰山一帶的芷江、中方、洪江、溆浦、沅陵、新晃、隆回等縣[2]。刺葡萄果實品質優良、色艷多汁、產量高、果粒小、種子多、營養豐富,是極具地方特色的葡萄種植資源。因其原產我國南方地區,刺葡萄對溫熱多雨的氣候環境有著較強的適應能力,對霜霉病、白粉病、炭疽病、黑痘病和白腐病等真菌病害均有著較強的抵抗力[2-3]。

酚類物質主要來源于葡萄的果皮和籽中。在紅葡萄酒的釀造和儲藏過程中,酚類物質如黃烷醇、花色苷、黃酮醇、酚酸的變化規律對于葡萄酒的感官品質如口感、顏色乃至香氣都有著重要的影響。黃烷醇類物質作為葡萄酒的“骨架”,為葡萄酒貢獻了澀感和收斂性。在葡萄酒陳釀過程中,隨著黃烷醇類物質的聚合反應和變化,葡萄酒會逐漸變得圓潤、飽滿,改變葡萄酒的特有結構感[4]。花色苷作為葡萄酒中主要的呈色物質,在紅葡萄酒釀造過程中,經破碎、浸漬作用和酒精發酵逐漸萃取進入葡萄酒中,其結構和含量隨之發生一系列的變化,從而對葡萄酒的顏色品質和穩定性產生極大的影響[5]。葡萄酒中的黃酮醇類物質多以糖苷形式存在,賦予葡萄酒苦味和由白到黃的色調[6],這類物質可以通過與花色苷類物質的輔色作用使葡萄酒的顏色更穩定[7-8]。在葡萄酒發酵和陳釀過程中,酚酸類物質參與葡萄酒中的多種氧化還原反應和褐變反應,影響葡萄酒的顏色,另外一些酚酸類的前體物質,如丁香醛和香草醛等,可以賦予葡萄酒特殊的香氣[9]。

本研究從刺葡萄酒發酵過程中酚類物質的含量變化入手,以期為制定刺葡萄酒釀造工藝和改進方案提供一定的理論依據,有助于生產優質刺葡萄酒,促進刺葡萄產業的發展,實現其經濟價值和社會效益[10]。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

刺葡萄(品種分別是米葡萄和甜葡萄):湖南懷化地區;甲醇、乙腈、甲酸和乙酸(均為色譜純):美國Fisher公司、乙酸乙酯(分析級):北京藍弋化工用品有限責任公司;去離子水:采用Milli-Q系統制備的超純水;標樣沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、斛皮素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷:美國Sigma公司;酵母Red Fruit:意大利Enartis公司;乳酸菌LALVIN31:加拿大Lallemand公司。

1.2儀器與設備

R-2001VN旋轉蒸發儀:北京賽美思儀器設備有限公司;配有二極管陣列檢測器(diodearraydetector,DAD)的Agilent 1100系列高效液相色譜-紫外-質譜(high performance liquid chromatography-ultravolet-mass spectrum,HPLC-UV-MS)儀:美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1葡萄酒釀造方法

葡萄果實所有指標達到釀造標準(24~25°Bx,總酸度5~6 g/L,以酒石酸計),在除梗破碎之前,每串葡萄都經過人工挑選,去除生長狀況不好和受傷的葡萄果粒,葡萄破碎入罐后,發酵罐中入料200L,并加入60mg/L二氧化硫、每罐添加50g護色單寧、接種20g/m3RedFruit酵母啟動酒精發酵,溫度控制在24~26℃,并在酒精發酵階段補加50 g護色單寧,酒精發酵至殘糖≤4 g/L后終止,為期14 d。進行皮渣分離后接種商業乳酸菌LALVIN31開啟蘋果酸-乳酸發酵,為期25d,蘋乳發酵結束后酒精度為9.95%vol(含酸量為7.3~7.8g/L,揮發酸含量為0.44~0.54g/L,以酒石酸計)。

1.3.2酚類物質檢測前的上樣前處理

葡萄酒的酚類物質提取及上樣分析采用的是本實驗室已報道過的方法[11]:非花色苷酚類物質先經過提取,具體流程為:取100 mL葡萄酒和等體積去離子水混合,再加入80 mL乙酸乙酯萃取,反復3次,取上清液于30℃旋蒸儀蒸干,蒸干后的剩余部分用5 mL色譜級甲醇溶解,溶解后的樣品經0.22 μm有機膜過濾,準備進行LC-UV-MS檢測。

花色苷分析前,葡萄酒樣品直接經0.45 μm水系膜過濾,準備進行HPLC-UV-MS檢測。

1.3.3非花色苷酚類物質的分析

采用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀進行花色苷的檢測。高效液相色譜條件:色譜柱Zorbax SB-C18(3 mm×50 mm,1.8 μm);柱溫25℃;進樣量2 μL;檢測波長280 nm。流動相A:10%乙酸水溶液;流動相B:10%乙酸乙腈溶液;流速1.0mL/min;梯度洗脫程序:0~5 min,5%~8%B;5~7 min,8%~12%B;7~12 min,12%~18%B;12~17 min,18~22%B;17~19min,22%~35%B;19~21min,35%~100%B;21~25min,100%~100%B;25~27 min,100%~5%B。質譜條件:離子源為電噴霧電離源,負離子模式;霧化器壓力為206.85 kPa;干燥氣流速為10 mL/min;干燥氣溫度為325℃;離子掃描范圍為100~l 500 m/z;電子碰撞池的MS/MS誘導碰撞電壓為1.0 V。

1.3.4花色苷的分析

采用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜—質譜聯用儀進行花色苷的檢測。質譜儀檢測器(mass spectrometer detector,MSD)包括電噴霧離子源和離子阱質譜檢測器,所有部件均由安捷倫v.5.2化學工作站控制。高效液相色譜條件:色譜柱Kromasi1100-5C18柱(4mm×250mm,6.5μm);流動相A為水∶甲酸∶乙腈=92∶2∶6(V/V);流動相B為水∶甲酸∶乙腈=44∶2∶54(V/V)。洗脫程序為0~18min,10%~25%B;18~20min,25%B;20~30min,25%~40%B;30~35 min,40%~70%B;35~40 min,70%~100%B;流速1 mL/min,柱溫50℃,檢測波長525 nm,波長掃描范圍200~900 nm,進樣量30 μL。質譜條件:離子源為電噴霧離子源,正離子模式,離子掃描范圍100~1500 m/z,霧化器壓力241.33 kPa,干燥氣流速10 L/min,干燥氣溫度350℃。

1.3.5數據分析

黃酮醇、黃烷-3-醇、羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、花色苷類物質分別以槲皮素、兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標的物,每個樣品做了3次平行處理。應用SPSS軟件進行數據差異性分析;數據以均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1黃酮醇類各物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段黃酮醇類物質含量變化趨勢見圖1。由圖1可知,在發酵初期,黃酮醇類物質含量主要表現為較低而穩定的水平,這應該是在發酵初期由于浸漬作用尚未充分導致來自葡萄果實和果皮的黃酮醇類物質浸出有限造成的,隨著后期發酵的進行,原料所受到的浸漬作用增強,黃酮醇類物質含量開始有顯著增加。兩種刺葡萄酒的黃酮醇最終總含量均達到65 mg/L左右,各類物質變化趨勢在不同的刺葡萄酒中基本一致。整個發酵階段中,米葡萄相對于甜葡萄其槲皮素-3-O-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷處于較高水平,而其他黃酮醇類物質在甜葡萄酒中的含量較在米葡萄酒中要高。兩種刺葡萄酒在發酵結束后除了楊梅酮-3-O-葡萄糖苷以外的各類黃酮醇類物質含量均存在顯著性差異。

圖1 兩種刺葡萄酒釀造各階段黃酮醇類物質含量及變化趨勢Fig.1 Contents and change trends of flavonols compounds during twoV.davidiigrape wine vinification

2.2黃烷-3-醇類各物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段黃烷-3-醇類物質含量變化趨勢見圖2。由圖2可知,整個發酵階段共實現了5種黃烷-3-醇類物質的定量,其中包括2種單體物質兒茶素、表兒茶素,2種二聚體物質原花青素B1、原花青素B2,一種三聚體物質原花青素C1。兩種刺葡萄酒的最終黃烷-3-醇類物質均以原花青素B1為主,且發酵過程結束后,黃烷-3-醇總含量相對于發酵前有顯著增加。在酒精發酵階段(取樣點1~4),黃烷-3-醇類物質的浸出含量變化并不明顯,原花青素B2和原花青素C1在此階段并未在樣品中被檢測到,但在進入蘋乳發酵以后,黃烷-3-醇類物質的含量上升迅速,此前未檢測到的原花青素B2和原花青素C1也開始出現,這應該和長時間浸漬有關。兩種刺葡萄為原料的葡萄酒相比較,5種黃烷-3-醇類物質的發酵趨勢基本保持一致,而米葡萄酒在發酵初期的黃烷-3-醇類物質總量雖然低于甜葡萄酒黃烷-3-醇類物質總量,但其最終的黃烷-3-醇類物質總量大約是甜葡萄酒黃烷-3-醇類物質總量的4倍,這說明米葡萄酒在黃烷-3-醇方面的浸漬潛力要較甜葡萄酒強,而酒最終的收斂性也會較甜葡萄酒明顯。兩種刺葡萄酒的5種黃烷-3-醇類物質含量在發酵結束后相比,均具有顯著性差異。

圖2 兩種刺葡萄酒釀造各階段黃烷-3-醇類物質含量及變化趨勢Fig.2 Contents and change trends of flavan-3-ols compounds during twoV.davidiigrape wine vinification

2.3羥基苯甲酸類各物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段羥基苯甲酸類物質含量變化趨勢見圖3。由圖3可知,檢測到的3種羥基苯甲酸類物質中,除了沒食子酸表現比較一致,丁香酸和原兒茶酸在酒精發酵階段均體現出了不同程度的增減變化,這應該是由于在此階段來自不同原料的刺葡萄酒中羥基苯甲酸酯的分解、羥基苯甲酸類物質的浸出和氧化的綜合影響產生的結果。但在進入蘋乳發酵階段以后,3種羥基苯甲酸類物質的變化趨勢開始趨于一致,說明影響羥基苯甲酸類物質增減的各種反應達到平衡狀態。除原兒茶酸外,米葡萄酒羥基苯甲酸類物質含量與甜葡萄羥基苯甲酸類物質含量相比,均具有顯著性差異。

圖3 兩種刺葡萄酒釀造各階段羥基苯甲酸類物質含量及變化趨勢Fig.3 Contents and change trends of hydroxybenzoic acids during twoV.davidiigrape wine vinification

2.4羥基肉桂酸類各物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段羥基肉桂酸類物質含量變化趨勢見圖4。由圖4可知,檢測到的兩種刺葡萄酒中3種羥基肉桂酸物質在發酵階段的變化趨勢大致相同,刺葡萄酒中的4-羥基肉桂酸和阿魏酸在發酵的不同時間段所表現出的不同程度的增減應該是刺葡萄酒中羥基肉桂酸酯的分解、羥基苯甲酸類物質的浸出和氧化的綜合影響產生的結果。其中,甜葡萄酒的羥基肉桂酸在發酵過程中的變化幅度較米葡萄更加明顯,說明發生在甜葡萄酒樣品中影響羥基肉桂酸形成或減少的反應更加劇烈。同時,在發酵結束后甜葡萄酒中的各種羥基肉桂酸類物質含量也比米葡萄酒中的各種羥基肉桂酸類物質含量要高,結合兩種葡萄酒的羥基肉桂酸類物質在發酵過程中的變化趨勢和各自的變化程度來看,應該是由于甜葡萄本身羥基肉桂酸來源比較豐富,同時浸出和生成速率也要高于米葡萄所造成的。兩種刺葡萄酒在發酵結束后3種羥基肉桂酸類物質含量比較上均具有顯著性差異。

圖4 兩種刺葡萄酒釀造各階段羥基肉桂酸類物質含量及變化趨勢Fig.4 Contents and change trends of hydroxycinnamic acids during twoV.davidiigrape wine vinification

2.5非酰化花色苷類各物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段非酰化花色苷類物質含量變化趨勢見圖5。由圖5可知,共檢測出7種非酰化花色苷類物質,包括5種雙糖苷物質和2種單糖苷物質,其中雙糖苷類物質占到絕大多數,主要是以二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷為主。基本上所有花色苷類物質含量在發酵初期(取樣點1、2)先經歷了一個減少過程,這應該是由于浸漬效果尚未顯現前,葡萄汁中來自果實破碎的有限的花色苷物質氧化減少,而花色苷沒有及時補充所造成的。在經過取樣點2以后,各類非酰化花色苷物質開始出現持續的上升,對新鮮葡萄酒的顏色做出貢獻。發酵結束后,甜葡萄酒在主要的非酰化花色苷物質含量上比米葡萄酒高,除了二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3,5-O-雙葡萄糖苷,兩種刺葡萄酒其他非酰化花色苷類物質在含量上均具有顯著性差異。

圖5 兩種刺葡萄酒釀造各階段非酰化花色苷類物質含量及變化趨勢Fig.5 Contents and change trends of non-acyted anthocyanins during twoV.davidiigrape wine vinification

2.6酰化花色苷類物質含量變化趨勢

兩種葡萄酒釀造各階段酰化花色苷類物質含量變化趨勢見圖6。

圖6 兩種葡萄酒釀造各階段酰化花色苷類物質含量及變化趨勢Fig.6 Contents and change trends of acyted anthocyanins during twoV.davidiigrape wine vinification

由圖6可知,共檢測出8種酰化花色苷類物質,它們在成分和變化趨勢上和非酰化花色苷相似,7種酰化雙葡萄糖苷為主要成分,香豆酰化3,5-O-二甲花翠素占主導地位,發酵前期受有限的浸漬和持續的氧化反應的影響,主要花色苷物質的變化體現出不同程度的增減,在后期浸漬效果大于氧化降解效果以后主要的酰化花色苷類物質含量又表現出持續的增加。發酵結束后甜葡萄酒的酰化花色苷類物質含量達到69 mg/L,是米葡萄酒的1.7倍,且兩種刺葡萄中主要的酰化花色苷(香豆酰化二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、乙酰化二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷、香豆酰化二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、香豆酰化甲基花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷)均具有顯著性差異。酰化花色苷類物質其化學性質較非酰化花色苷類物質穩定,對于葡萄酒陳釀和儲存階段的顏色穩定性有極大影響。結合非酰化花色苷的含量分析,甜葡萄酒在顏色方面的品質無論是發酵結束還是在后期陳釀和存放階段看來都要優于米葡萄酒。

2.7討論

在兩個品種的刺葡萄干紅葡萄酒發酵過程中,酚類物質在前期受浸漬程度和氧化程度影響,含量上的變化體現出不同程度的增減規律,但在發酵中后期由于浸漬作用的加強,絕大多數物質含量上表現出持續的上升,這在蘋乳發酵階段有最明顯的體現。有研究表明,酒體中的花色苷、原花青素等黃酮類物質會發生輔色作用、環加成、氧化、聚合等多種復雜反應而降解[12],這對于酒精發酵最初階段葡萄酒中有限的酚類物質下降可能也有一定影響。整個發酵過程結束后,米葡萄酒和甜葡萄酒的酚類物質總量分別達到446.55 mg/L、453.17 mg/L。本研究中的米葡萄酒和甜葡萄酒多酚物質含量應該還有進一步提升的潛力。

米葡萄酒和甜葡萄酒的黃酮醇類物質的總量分別達到了65.99mg/L和63.57 mg/L,分別占到本研究多酚總量的14.2%和14.6%,其中槲皮素-3-O-鼠李糖苷占主導地位,在米葡萄酒和甜葡萄酒中分別占據了總黃酮醇含量的71.56%和60.4%。其他研究表明,在刺葡萄品種紫秋和湘珍珠中槲皮素-3-O-鼠李糖苷占到總黃酮醇含量的50%以上[13],與該研究相一致。

與歐亞種葡萄一致[14-15],米葡萄中黃烷-3-醇的含量很高,達到了117 mg/L,是最主要的酚類物質,其中最多的是原花青素B1。而甜葡萄的黃烷-3-醇含量很低,最終只達到31.39 mg/L。黃烷-3-醇類物質對于葡萄酒口感有重要貢獻,米葡萄酒相對于刺葡萄酒在黃烷-3-醇類物質含量上的較高含量最終會導致前者具有更加明顯的收斂性。

酚酸類物質可分為羥基苯甲酸和羥基肉桂酸,其中米葡萄的羥基肉桂酸的含量高,達到9.43 mg/L,而甜葡萄羥基苯甲酸含量高,為7.57 mg/L。實驗一共檢測到三種羥基苯甲酸類物質,其中沒食子酸含量最高,與歐亞種葡萄一致[16-17],雖然酚酸類物質沒有顏色,但是對于葡萄酒陳釀儲藏階段顏色的穩定性有著重要作用。

該研究中甜葡萄酒和米葡萄酒的花色苷的總量分別達到了255.13 mg/L和341.2 mg/L。而李華等[18]研究了37種來自于中國不同地區的葡萄酒中的酚類物質得出葡萄酒中的花色苷含量為59~286 mg/L,赤霞珠葡萄酒的花色苷含量是(70.7±1.8)mg/L,平均值大約為135 mg/L。由此可見,本研究中的兩種刺葡萄酒的花色苷含量遠高于其平均值且都超過了其上限。在其他類似的研究中也表明,刺葡萄酒中的花色苷含量遠遠高于其他品種的葡萄[3,13]。兩種刺葡萄酒的花色苷大部分是雙糖苷,其中含量最多的是是二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷。在美洲種葡萄中,也檢測到了一定量的單糖苷和雙糖苷,并含有較多的香豆酰化葡萄糖苷和較少的乙酰化葡萄糖苷,并且在河岸葡萄和沙地葡萄中,雙糖苷都比單糖苷豐富的多,這在一定程度上有利于葡萄酒顏色的穩定[19-20]。

3 結論

本研究以兩種湖南刺葡萄品種(米葡萄和甜葡萄)為原料釀造干紅葡萄酒,并利用高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)技術分析在其釀造過程中酚類物質的含量變化。結果表明,在整個釀造過程中,兩種刺葡萄酒中酚類物質的變化基本一致,總體呈現出在酒精發酵階段先上升再下降,而蘋乳發酵結束后酚類物質均明顯上升,達到最高點。黃酮醇類物質中含量較高的有槲皮素-3-O-鼠李糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷。兩種刺葡萄酒黃烷-3-醇每種物質的趨勢變化一致,但米葡萄酒的含量是甜葡萄酒的3.7倍,含量最多的是原花青素B1。羥基苯甲酸類物質中最多的是沒食子酸,羥基肉桂酸類物質中含量最多的是咖啡酸。值得注意的是,刺葡萄酒含有非常豐富的花色苷,其中占主導地位的花色苷是雙糖苷,最多的是二甲花翠素-3,5-O-雙葡萄糖苷。兩個品種刺葡萄米葡萄和甜葡萄酒中酚類物質的總量分別達到了446.55 mg/L和453.17 mg/L,其中米葡萄酒的黃酮醇、黃烷醇含量高于甜葡萄酒,而甜葡萄羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和花色苷類物質的含量比米葡萄酒高。所以甜葡萄酒的顏色會更偏向于紫紅色,而米葡萄酒的澀感會更強烈一些。

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Content variation of several polyphenol compounds during vinification of dry red wines made fromVitis davidiigrapes

ZHU Yinjie,GUO Sijiang,LI Siyu,HE Fei*
(Center for Viticulture and Enology,College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Using two dry red wines fermented by grapes(Vitis davidii)cultivars:Miputao and Tianputao from Hunan province as research object,the polyphenol compounds during the wine making was analyzed by HPLC-MS.The results showed that six classes of phenolic compounds were detected in the dry red wine samples,including 7 flavonol compunds,5 flavan-3-ols compunds,3 hydroxybenzoic acid compunds,3 hydroxycinnamic acid compunds,7 non-acylated anthocyanin compunds and 8 acylated anthocyanin compounds.During the whole fermentation,both Miputao wine and Tianputao wine showed a noticeable increase of phenolic compounds after the malo-lactic fermentation.The contents of flavonols and flavan-3-ols in Miputao were higher than those in Tianputao wine,while the Tianputao wine contained higher contents of the other four phenolic compounds.

Vitis davidii;phenolic compounds;HPLC-MS;alcohol fermentation;change

Q815

0254-5071(2016)03-0045-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.011

2015-11-28

2015年國家級-創新訓練項目(201510019078)

祝音潔(1994-),女,本科生,研究方向為葡萄酒工程。

何非(1983-),男,副教授,博士,研究方向為釀酒葡萄栽培與葡萄酒釀造。

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