酶輔助超聲提取紫蘇迷迭香酸工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

黃丹丹，朱秋勁，2，3*，沈　奇，彭　煒，羅自生，茅林春

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)分中心，貴州 惠水 550600；4.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽 550008；5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

酶輔助超聲提取紫蘇迷迭香酸工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

黃丹丹1，朱秋勁1，2，3*，沈奇4，彭煒1，羅自生5，茅林春5

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.國家牛肉加工技術(shù)研發(fā)分中心，貴州 惠水 550600；4.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽 550008；
5.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

通過單因素試驗(yàn)研究超聲波功率、料液比、超聲時(shí)間對(duì)紫蘇迷迭香酸提取量的影響，采用響應(yīng)面分析法和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法輔助超聲波提取迷迭香酸的最佳工藝參數(shù)，并通過迷迭香酸對(duì)抗豬油氧化能力和清除羥自由基的能力來研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，迷迭香酸最佳提取工藝為纖維素酶添加量3%、超聲功率320 W、超聲時(shí)間10 min、料液比1∶40（g∶mL）。在此最佳條件下，迷迭香酸提取量為1.426 mg/g。迷迭香酸對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除能力，并能有效抑制豬油氧化。

紫蘇；迷迭香酸；響應(yīng)面；酶輔助超聲提??；抗氧化

紫蘇（Perilla frutescensL.）是一年生直立草本植物，別名：赤蘇、桂茬、荏子等；紫蘇主要用于藥用、食用、香料、油用等各方面，其紫蘇葉可以生食、煲湯等［1-3］。紫蘇在我國有近2 000年的種植歷史，資源分布廣闊。貴州獨(dú)特的喀斯特地貌使得紫蘇的種植有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢，而且具有豐富的野生資源。紫蘇葉具有味辛、歸肺、脾經(jīng)、散寒解表等功效，且療效極佳，其中含較為豐富的迷迭香酸（rosmarinic acid，RosA），其具有較強(qiáng)的抗氧化劑［4］，能阻斷亞硝基類物質(zhì)的作用、消除一定的自由基、防止脂質(zhì)過氧化［5-9］，可廣泛用于化妝品、功能食品及調(diào)味品等領(lǐng)域。

目前，國內(nèi)外提取迷迭香酸的主要方法為熱水浸提法、微波和超聲波輔助法等［10-13］。迷迭香酸被紫蘇葉的細(xì)胞壁包裹住難于溶性，利用纖維素酶破壞紫蘇葉細(xì)胞壁，加速迷迭香酸的溶出；超聲波輔助提取是利用高頻機(jī)械振蕩波［14］，促進(jìn)紫蘇葉中迷迭香酸的溶出，具有短時(shí)高效的特點(diǎn)。本試驗(yàn)以紫蘇葉為原料，將乙醇溶液作為提取溶劑，利用纖維素酶輔助超聲波法提取迷迭香酸［15］，通過響應(yīng)面優(yōu)化提取條件，再通過對(duì)羥基自由基清除率及抗油脂氧化能力的測定，研究其抗氧化活性，為紫蘇葉的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紫蘇葉樣品（成熟期葉片，奇蘇三號(hào)品種）：采于貴州省油菜研究所紫蘇種植基地；迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%）：天津士蘭科技有限公司；纖維素酶（酶活力≥15 000 U/g）：貴州賽蘭博科技有限公司；乙腈、氫氧化鈉、磷酸、無水乙醇、濃鹽酸、鄰苯三酚、維生素C（vitamin C，VC）、維生素E（vitamin E，VE）：美國Sigma公司。所有化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。

1.2儀器與設(shè)備

BPCL-2-JZ-TG微弱發(fā)光儀（高壓900 V）：北京建新力拓科技有限公司；GT SONIC-P20型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：廣東固特超聲股份有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司；CP-214型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1紫蘇葉前處理

將新鮮紫蘇葉洗凈后放入干燥箱38℃烘干24 h。用粉碎機(jī)粉碎后用60目篩過濾，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2纖維素酶法提取

稱取1.00 g紫蘇葉粉末樣品，置于具塞錐形瓶內(nèi)，加入3%的纖維素酶，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液30 mL，調(diào)節(jié)pH至4，在45℃條件下酶解12 min，再經(jīng)20 min熱回流提取后過濾，殘?jiān)酝瑯拥姆椒ㄔ偬崛?次，合并2次提取液，用蒸餾水定容至100 mL［16］，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3迷迭香酸含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

迷迭香酸含量測定采用高效液相色譜法。色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：含1%磷酸的蒸餾水∶乙腈60∶40（V/V），檢測波長320 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速0.5 mL/min。

迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品并用蒸餾水溶解稀釋質(zhì)量濃度分別為20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L，由HPLC測出迷迭香酸峰面積，并以迷迭香酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，迷迭香酸峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線［17］，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品迷迭香酸含量。

1.3.4酶法輔助超聲波提取迷迭香酸單因素試驗(yàn)

稱取1.00 g紫蘇葉粉末，加入3%纖維素酶，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液30 mL，在提取溫度45℃，于超聲波清洗機(jī)中提取不同時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min），不同功率（80 W、160 W、240 W、320 W、400 W），不同液料比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）），考察超聲功率、料液比及提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸提取量的影響，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以超聲功率、料液比和超聲時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以迷迭香酸提取量（Y）作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高3個(gè)水平，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3.6迷迭香酸的抗氧化活性測定

（1）抗油脂氧化能力測定

依據(jù)照陳輝等［18］所述方法，精確稱取紫蘇葉中迷迭香酸提取物0.02 g，添加到50 g豬油（室溫）中，充分混勻；再置入（45±1）℃培養(yǎng)箱中，每隔5 d測定過氧化值（peroxide value，POV），測定方法按照國標(biāo)GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的碘量法，測出POV的值，POV是100 g油脂中過氧化物氧化碘化鉀所析出碘的克數(shù)，它反應(yīng)油脂氧化程度，POV值越大，氧化程度越大。空白組不加迷迭香酸粗提物，陽性對(duì)照組加相同質(zhì)量的VE和VC。POV計(jì)算公式如下：

式中：POV為試樣的過氧化值，mmol/L；V1為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為試劑空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；M為試樣質(zhì)量，g；0.126 9為與1.00 mL硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液｛C（Na2S2O3）=0.002 0 mol/L｝相當(dāng)?shù)牡獾馁|(zhì)量，g。

（2）羥自由基清除能力測定

參照李穎暢等［19］所述方法，在反應(yīng)體系中加入1 mL 10mmol/L的FeSO4溶液，分別取1mL質(zhì)量濃度為0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL的迷迭香酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后加入1 mL 8.8mmol/L H2O2溶液啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)30 min，在510 nm波長處測定各濃度的吸光度值?？瞻捉M用水代替樣品，對(duì)照組用同等質(zhì)量濃度的VE和VC代替，每個(gè)樣品重復(fù)3次。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為對(duì)照液的吸光度值；A1為加入迷迭香酸溶液后的吸光度值；A2為不加顯色劑H2O2迷迭香酸溶液的吸光度值。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 18.0和Design-Expert V 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以迷迭香酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)作圖，得到迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1　迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rosmarinic acid

由圖1可知，迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3 799.3x+ 18 287，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。結(jié)果表明，迷迭香酸含量與峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2酶法輔助超聲波提取迷迭香酸的單因素試驗(yàn)結(jié)果

分別考察補(bǔ)充超聲波功率、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)單因素對(duì)紫蘇葉中迷迭香酸提取量的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，當(dāng)超聲波功率在100～320 W，隨著超聲波功率的加大，迷迭香酸的提取量逐漸提高；在超聲波功率為320 W，迷迭香酸的提取量達(dá)到最大值1.026 mg/g，這主要是因?yàn)槊缘闼岽嬖谟谧咸K葉的細(xì)胞壁中，通過超聲波破壞紫蘇葉的細(xì)胞壁，使迷迭香酸更易于被提取出來。當(dāng)超聲波提取量＞320 W之后，隨著超聲波功率的增加，迷迭香酸得率開始下降。但當(dāng)超聲波功率＞320 W時(shí)，會(huì)導(dǎo)致提取物中部分莽草酸結(jié)構(gòu)顯著破壞，導(dǎo)致提取物中迷迭香酸的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞。因此，超聲功率為320 W為宜。

圖2　超聲功率（A）、料液比（B）及超聲時(shí)間（C）對(duì)迷迭香酸提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power（A），solid-liquid ratio（B）and ultrasound time（C）on extraction quantity of rosmarinic acid

由圖2B可知，料液比在1∶20～1∶50（g∶mL），隨著料液比的增大，迷迭香酸的提取量逐漸提高；在料液比為1∶50（g∶mL），迷迭香酸的提取量達(dá)到最大值0.931 mg/g；當(dāng)料液比＞1∶50（g∶mL）之后，隨著料液比的增加，迷迭香酸得率開始下降，而且料液比過大，溶劑用量和下一步濃縮工藝的能耗都會(huì)增加［20］。因此，液料比在1∶50（g∶mL）為宜。

由圖2C可知，提取時(shí)間在10～30 min，隨著提取時(shí)間的延長，迷迭香酸的提取量隨之增加；在提取時(shí)間為30 min時(shí)，迷迭香酸的提取量達(dá)到最大值1.226 mg/g，這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間增加，細(xì)胞膜里越多的物質(zhì)流出；提取時(shí)間＞30 min之后，迷迭香酸得率反而下降，超聲波作用會(huì)使提取物中部分迷迭香酸的結(jié)構(gòu)受破壞。因此，提取時(shí)間以30 min左右為宜。

2.3酶輔助超聲波法提取迷迭香酸的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1回歸方程的建立與方差分析

參照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了迷迭香酸提取量（Y）對(duì)超聲波功率（A）、超聲時(shí)間（B）和料液比（C）二次多項(xiàng)式回歸方程：

為檢驗(yàn)方程有效性，利用分析軟件對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行分析酶輔助超聲波提取迷迭香酸得率，多元回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果見表3。

表3　回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知，本試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.0841＞0.05，模型與試驗(yàn)值之間變化小，此模型線性相關(guān)系數(shù)R2=95.21%、調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=91.38%，表明該模型擬合程度良好，模型可以用來分析和預(yù)測。一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.3.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化

利用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行二次多元擬合得出響應(yīng)面圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖，在固定其他因素水平值的情況下觀察各因素間的交互作用對(duì)迷迭香酸提取量的影響，所得響應(yīng)面及等高線見圖3。

由圖3可知，在響應(yīng)面上其中每兩個(gè)交互因素都有一個(gè)最高點(diǎn)，超聲時(shí)間和功率對(duì)迷迭香酸提取量的影響較大，而超聲時(shí)間的影響相對(duì)較弱。由圖3a可知，隨著超聲功率（的增大或減弱，迷迭香酸提取量提升或降低，其曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小；由圖3b可知，迷迭香酸提取量隨超聲功率不變，提取量隨著料液比的增加先增加后減小，而料液比不變時(shí)，迷迭香酸提取量隨超聲功率提高而增大但不明顯，其曲線教為平滑，響應(yīng)值變化??；由圖3c可知，在超聲波功率不變時(shí)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，料液比和超聲時(shí)間交互作用顯著，其曲線陡峭，響應(yīng)變化值較大。

圖3　超聲功率、料液比及提取時(shí)間交互作用對(duì)迷迭香酸提取量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.3 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic power，solid-liquid ratio and extraction time on extraction quantity of rosmarinic acid

利用Design-ExpertV8.0軟件分享得到紫蘇葉中迷迭香酸提取最佳條件為超聲功率為320W、料液比為1∶40（g∶mL）、超聲時(shí)間為10 min，在此提取條件下，紫蘇葉中迷迭香酸提取量的預(yù)測值為1.537 mg/g。為了驗(yàn)證該響應(yīng)面結(jié)果的可行性，在軟件分析的最佳條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，迷迭香酸平均提取量為1.426 mg/g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.079 mg/g。因此在該條件下試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，響應(yīng)面結(jié)果可靠。

2.4抗氧化分析

2.4.1抗豬油氧化能力

由圖4可知，隨著時(shí)間的增加，空白組豬油的POV值從0.040 mmol/L一直上至0.176 mmol/L添加迷迭香酸的豬油的POV值從0.037 mmol/L一直上升到0.120 mmol/L，說明迷迭香酸對(duì)豬油有一定的抗氧化作用。在同一時(shí)間段上，迷迭香酸對(duì)豬油的POV值大于VC，弱于VE，因此迷迭香酸抗氧化性優(yōu)于VC，低于VE。在25 d時(shí)，迷迭香酸抗氧化作用的上升趨勢開始減弱，這是因?yàn)槊缘闼嶂械姆恿u基中氧化還原電位產(chǎn)生變化，導(dǎo)致自身進(jìn)行氧化作用。結(jié)果表明，迷迭香酸對(duì)豬油具有抗氧化作用。

圖4　不同抗氧化劑對(duì)豬油抗氧化效果的影響Fig.4 Effect of different antioxidants on antioxidant effect of lard

2.4.2清除羥自由基能力

圖5　不同抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除作用的影響Fig.5 Effect of different antioxidants on scavenging effect of hydroxyl free radical

由圖5可知，迷迭香酸具有一定清除羥自由基的能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，VC、迷迭香酸、VE三種物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除能力隨濃度的上升而逐漸增強(qiáng)。迷迭香酸質(zhì)量濃度在0～0.3 mg/mL時(shí)，羥自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的上升而較快增強(qiáng)，當(dāng)迷迭香酸質(zhì)量濃度＞0.3 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)50%以上；比同質(zhì)量濃度的VE清除率大，但比同質(zhì)量濃度的VC清除率小。結(jié)果說明紫蘇葉中迷迭香酸具有一定清除羥自由基能力。

3　結(jié)論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助超聲波法提取迷迭香酸最佳工藝條件，結(jié)果表明，迷迭香酸最佳提取工藝為纖維素酶添加量3%、超聲功率480W、超聲時(shí)間10min、料液比1∶40（g∶mL），在此最佳條件下，迷迭香酸提取量為1.426 mg/g。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫蘇葉提取迷迭香酸具有一定的抗豬油氧化能力及清除羥自由基能力。

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Optimization of enzyme-assisted ultrasonic extraction technology of rosmarinic acid from Perilla frutescensand its antioxidant activity

HUANG Dandan1，ZHU Qiujin1，2，3*，SHEN Qi4，PENG Wei1，LUO Zisheng5，MAO Linchun5
（1.College of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province，Guiyang 550025，China；3.Branch Center of National Beef Processing Technology Research，Huishui 550600，China；4.Guizhou Rapeseed Institute，Guiyang 550008，China；5.Fuli Institute of Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

The effects of ultrasonic power，solid-liquid ratio and ultrasonic time on extraction quantity ofPerilla frutescensrosmarinic acid were researched by single factor experiments.The optimum enzyme-assisted ultrasonic extraction technology parameters of rosmarinic acid were optimized by response surface methodology and Box-Behnken experiments.The antioxidant activity of rosmarinic acid on lard oil and hydroxyl radical was researched.The results showed that the optimum extraction conditions of rosmarinic acid was cellulose 3%，ultrasonic power 320 W，ultrasonic time 10 min，solid-liquid ratio 1：40（g：ml）.Under the optimum conditions，extraction quantity of rosmarinic acid was 1.426 mg/g.Rosmarinic acid had a strong ability of scavenging on hydroxyl free radical，which could inhibit lard oxidation effectively.

Perilla frutescens；rosmarinic acid；response surface methodology；enzyme-assisted ultrasonic extraction；antioxidant

TS202.3

0254-5071（2016）03-0089-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.020

2016-01-14

浙江大學(xué)馥莉食品研究院資助項(xiàng)目（KY201405）；貴州山區(qū)畜產(chǎn)品系列休閑方便肉食品產(chǎn)業(yè)化技術(shù)成熟化與示范應(yīng)用（700952142111）

黃丹丹（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工及貯藏。

朱秋勁（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工及貯藏。