甲氨蝶呤對固有免疫關鍵分子干擾素的影響研究

元建國，葉海艷，李世林△，陳利民▲

(1.成都大學門診部，成都 610000;2.中國醫學科學院/北京協和醫學院輸血研究所，成都 610063)

?

甲氨蝶呤對固有免疫關鍵分子干擾素的影響研究

元建國1，葉海艷2，李世林2△，陳利民2▲

(1.成都大學門診部，成都 610000;2.中國醫學科學院/北京協和醫學院輸血研究所，成都 610063)

目的為了探究具有免疫抑制和抗腫瘤作用的甲氨蝶呤(MTX)對干擾素(IFN)的影響，以及IFN在風濕免疫性疾病中的作用。方法以5、20、100 μg/mL濃度梯度的MTX作用于Huh7.5.1細胞48 h，采用實時熒光定量PCR法定量檢測MTX干預后Huh7.5.1細胞內IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干擾素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表達量。結果Huh7.5.1細胞在MTX(5、20 μg/mL)干預下內源性IFN-α、IFN-β的mRNA表達量與對照組相比均明顯上升,差異均有統計學意義(P<0.05),并且隨著MTX干預濃度的上升而上升；MTX 濃度為 100 μg/mL 時，與對照組相比雖有上升但差異無統計學意義(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表達量僅在MTX濃度為20 μg/mL時與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，在5、100 μg/mL 時雖有上升但差異無統計學意義(P>0.05)。在MTX干預后，MxA和ISG15的mRNA表達量均有不同程度的上升(P<0.05)。結論小劑量MTX治療風濕免疫性疾病取得良好的療效與IFN相關。

甲氨蝶呤；固有免疫；干擾素

固有免疫是機體與生俱來的抵御病原微生物入侵的第一道防線，具有抵抗體外病原體侵襲、清除體內抗原性異物的能力，是生物體在漫長的進化和自然選擇過程中形成的防御機制[1]。固有免疫具有抗感染、抗腫瘤、維持自身耐受，以及啟動和參與特異性免疫等作用[2]。干擾素(IFN)是固有免疫系統重要的固有免疫分子，是最早發現的細胞因子，因其具有干擾病毒的感染和復制功能而得名。根據其來源和理化性質，可分為Ⅰ型(IFN-α、IFN-β)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型。

IFN-α、IFN-β由許多不同的細胞(所有有核細胞，特別是成纖維細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)在應答病毒或胞內細菌感染時產生。IFN-α、IFN-β 的受體相同，幾乎表達于所有有核細胞表面，功能廣泛，包括抗病毒、免疫調節，以及促進組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子和Ⅱ類分子的表達。IFN-γ主要由活化的T細胞、自然殺傷細胞誘導產生，具有抗病毒，活化巨噬細胞，促進MHC分子表達的抗原提呈，誘導Th1分化，抑制Th2分化的作用[3-4]。

甲氨蝶呤(MTX)用于風濕免疫性疾病已數十年，被全世界的風濕免疫學者普遍接受，在治療類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、血管炎、干燥綜合征等疾病中都取得了良好的效果[5]。MTX是二氫葉酸還原酶抑制劑，是一種葉酸拮抗劑，與二氫葉酸還原酶底物葉酸結構相似，能有效地占據酶催化中心，它與該酶的結合力比葉酸大106倍，對二氫葉酸還原酶呈強大而持久的競爭性抑制作用，使二氫葉酸不能變成四氫葉酸，導致DNA合成障礙，阻止嘌呤核苷酸的合成，而干擾蛋白質的合成[6-8]。

IFN是固有免疫分子中的一種細胞因子，是固有免疫系統重要的組成成分，在整個免疫系統中具有重要意義，但在風濕免疫性疾病中，IFN在疾病的發生、發展及轉歸、預后中的作用和地位尚不十分清楚，同時，臨床常用的免疫抑制劑對IFN的影響亦不明了。因此，為了探究MTX對IFN的影響，以及IFN在風濕免疫性疾病中的作用，本研究以不同濃度的MTX作用于Huh7.5.1細胞，采用實時熒光定量PCR法定量檢測MTX干預后Huh7.5.1細胞內IFN-α、IFN-β、IFN-γ、干擾素刺激基因15(ISG15)、抗黏病毒蛋白(MxA)的mRNA 表達量，探討并試圖從基因水平證明MTX對IFN的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞Huh7.5.1細胞:人肝癌細胞系，本實驗室長期保存。

1.1.2主要試劑及儀器MTX片；胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)購自Hycone公司；達氏修正依氏培養基(DMEM，高糖)購自Hyclone公司；非必需氨基酸(Non-essentialamino acids，NEAA)購自Gibico公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)購自Hyclone公司；0.25%的胰酶購自Gibico公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Gibico公司；IFN-α購自Merck&Co公司；Trizol購自Ambion公司；逆轉錄試劑盒購自Bio-rad公司；SYBR熒光染料試劑盒購自Roche公司。

倒置熒光顯微鏡(CKX31型)購自Olympus公司；Fast Real-Time PCR system(7500HT)購自Applied Biosystem公司；PCR儀(Veriti 96 Well)購自Applied Biosystem公司；二氧化碳培養箱購自Thermo electric公司；生物潔凈工作臺購自Airtech公司；96孔板離心機(3K15)購自Sigma公司；高速臺式冷凍離心機購自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1MTX片溶解液的配置配置0.71%的無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液和0.69%磷酸二氫鈉(NaH2PO4)溶液，取500 mL Na2HPO4溶液和600 mL NaH2PO4溶液混合搖勻，用2 mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液調節pH值為6.9。

1.2.2細胞培養、分組及RNA的提取(1)細胞培養:①用0.25%的胰酶將培養瓶中的細胞消化下來后轉移至50 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用完全培養基重懸細胞；②取10 μL細胞懸液至10 μL 0.4%臺盼藍中充分混勻后加入計數板中計數；③根據細胞密度加入完全培養基，調整細胞濃度為2×105/mL；④在24孔細胞培養板中每孔加入500 μL Huh7.5.1細胞懸液；⑤37 ℃ 5% CO2培養箱中過夜培養。(2)分組：細胞貼壁后進行藥物處理，將MTX加入細胞培養板中，使終濃度分別為5、20、100 μg/mL，每個濃度設3個重復孔，放入37 ℃ 5%CO2培養箱中繼續培養48 h；對照組細胞正常培養，未做任何處理。(3)RNA提取:將Trizol加入24孔細胞培養板中，每孔加入200 μL，反復吹打細胞后轉移至1.5 mL離心管中，室溫放置5 min。加入40 μL氯仿，劇烈振蕩10 s后室溫放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。吸取100 μL水相轉移入新的 1.5 mL離心管中，加入100 μL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，移去上清。加入 200 μL 75%乙醇，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清以洗滌沉淀。室溫放置使乙醇揮發后，加入 30 μL無RNA酶(RNase)的焦碳酸二乙酯(DEPC)水，用槍頭吸打幾次使其充分溶解，-80 ℃保存備用。

1.2.3引物的序列和合成[9-11]IFN-α：上游引物5′-TCG CCC TTT GCT TTA CTG AT-3′，下游引物5′-GGG TCT CAG GGA GAT CAC AG-3′；IFN-β：上游引物5′-AAA CTC ATA GCA GTC TGC A-3′，下游引物5′-AGG AGA TCT TCA GTT TCG GAG G-3′；IFN-γ：上游引物5′-CCA ACG CAA AGC AAT ACA TGA-3′，下游引物5′-TTT TCG CTT CCC TGT TTT AGC-3′；MxA：上游引物5′-GTG CAT TGC AGA AGG TCA GA-3′，下游引物5′-CTG GTG ATA GGC CAT CAG GT-3′；ISG15：上游引物5′-CGC AGA TCA CCC AGA AGA TT-3′，下游引物5′-GCC CTT GTT ATT CCT CAC CA-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游引物5′-GCC TCC TGC ACC ACC AAC TG-3′，下游引物5′-ACG CCT GCT TCA CCA CCT TC-3′。

1.2.4逆轉錄反應使用逆轉錄試劑盒，反應體系如下:5×Mix 1 μL，RNA模板3 μL，ddH2O 6 μL，總體積10 μL。反應條件:30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.2.5實時熒光定量PCR采用Roche公司的SYBR熒光染料試劑盒，反應體積為20 μL,反應體系:2×SYBR mix 10 μL，Primer-R 1μL，Primer-F 1μL，Template 1μL，ddH2O 7 μL。反應條件:95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環。采用2-△△CT法，以看家基因GAPDH作內參，得出待測目的基因mRNA相對表達量。

1.3統計學處理實驗均設3次獨立的重復實驗，數據采用ANOVA軟件進行統計分析，數據用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1各組細胞內IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA的表達比較Huh7.5.1細胞在MTX(5、20 μg/mL)干預下內源性IFN-α、IFN-β的mRNA表達量與對照組相比均上升,差異均有統計學意義(P<0.05)，并且隨著MTX干預濃度的上升而上升；MTX 濃度為 100 μg/mL 時，與對照組相比雖有上升但差異無統計學意義(P>0.05)。而IFN-γ的mRNA表達量僅在MTX濃度為20 μg/mL時與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，在5、100 μg/mL 時雖有上升但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

*：P<0.05，與對照組比較。

圖1不同濃度的MTX對Huh7.5.1細胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA表達量的影響

2.2各組ISG15、MxA mRNA的表達比較在MTX干預后，MxA和ISG15的mRNA表達量均有不同程度的上升，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

*：P<0.05，與對照組比較。

圖2MTX對ISG15、MxA mRNA表達量的影響

3　討　　論

在臨床實踐中，大劑量MTX被用于抗腫瘤治療，主要是抑制細胞增殖和復制，即抗增殖作用，是通過抑制二氫葉酸還原酶而阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，可阻止DNA合成，也可干擾RNA蛋白質的生物合成，從而達到阻止腫瘤細胞生成的作用[12]。而治療風濕免疫性疾病是小劑量應用，其作用機制不能完全用抗增殖進行解釋，每周1次小劑量治療風濕病的機制可能是幾種作用的結合，包括抗葉酸、免疫調節、免疫抑制及抗炎作用[13]。

IFN屬于細胞因子中的一類，主要有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等作用。本研究只涉及了Ⅰ型和Ⅱ型。IFN-α、IFN-β可由體內多種細胞產生，IFN-γ由自然殺傷細胞誘導產生，具有抗病毒和免疫調節的功能[14]。在正常生理情況下，多數細胞可以自發分泌少量內源性Ⅰ型IFN。IFN與干擾素受體(IFNR)結合激活Janus酪氨酸蛋白激酶/信號轉導子與轉錄激活子(janus kinase signal transducersand activators of transcription，JAK/STAT)信號通路，該通路在調節細胞增殖、分化、凋亡，以及在免疫調節、炎癥和腫瘤等多種病理生理過程中能發揮重要的作用[15]。

本實驗表明，MTX能明顯促進內源性IFN的分泌，并且能與IFNR結合激活IFN信號通路從而促進ISGs的表達，提示小劑量MTX治療風濕免疫性疾病取得的良好療效與IFN相關。本實驗結果可以為進一步研究MTX治療疾病的機制，以及對MTX的開發利用提供理論依據。

[1]曹雪濤，何維．醫學免疫學[M]．北京：人民衛生出版社，2015．

[2]柳愛華，寶福凱．近年來固有免疫研究中的一些重要進展[J]．自然雜志，2009，31(4)：218-222．

[3]馮盼盼，盧雪梅，金小寶，等．干擾素的藥理研究進展[J]．廣東藥學院學報，2014，30(6)：780-783．

[4]Samuel CE.Antiviral actions of interferons[J].Clin Microbiol Rev,2001,14(4):778-809.

[5]何澤民，王姿媛，蔡曉虹．甲氨蝶呤的臨床應用[J]．海峽藥學，2005，17(3)：119-121．

[6]Blits M,Jansen G,Assaraf YG,et al.Methotrexate normalizes up-regulated folate pathway genes in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2013,65(11):2791-2802.

[7]Spurlock CF,Gass HM,Bryant CJ,et al.Methotrexate-mediated inhibition of nuclear factor κB activation by distinct pathways in T cells and fibroblast-like synoviocytes[J].Rheumatology (Oxford),2015,54(1):178-187.

[8]周惠瓊，吳東海．甲氨蝶呤治療類風濕關節炎作用機制的研究進展[J]．中國藥物與臨床，2004，4(7)：497-499．

[9]Nagao M,Nakajima Y,Kanehiro H,et al.The impact of interferon gamma receptor expression on the mechanism of escape from host immune surveillance in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2000,32(3):491-500.

[10]Chen L,Borozan I,Feld J,et al.Hepatic gene expression discriminates responders and nonresponders in treatment of chronic hepatitis C viral infection[J].Gastroenterology,2005,128(5):1437-1444.

[11]Liu B,Chen S,Guan Y,et al.Type Ⅲ interferon induces distinct SOCS1 expression pattern that contributes to delayed but prolonged activation of Jak/STAT signaling pathway:implications for treatment Non-Response in HCV patients[J].PLoS One,2015,10(7):e0133800.

[12]Gonen N,Assaraf YG.Antifolates in cancer therapy:structure,activity and mechanisms of drug resistance[J].Drug Resist Updat,2012,15(4):183-210.

[13]向陽，蘇林沖．小劑量甲氨蝶呤治療類風濕關節炎的作用機理[J]．湖北民族學院學報(醫學版)，1999，16(2)：47-50．

[14]Iwasaki A.A virological view of innate immune recognition[J].Annu Rev Microbiol,2012,66(1):177-196.

[15]Stark GR,Darnell JE.The JAK-STAT pathway at twenty[J].Immunity,2012,36(4):503-514.

The effects of methotrexate on innate immune molecule interferon

Yuan Jianguo1，Ye Haiyan2，Li Shilin2△，Chen Limin2▲

(1.Department of Outpatient,Chengdu University,Chengdu,Sichuan 610000,China；2.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences/Peking Union Medical College,Chengdu,Sichuan 610063,China)

ObjectiveTo explore the effect of methotrexate(MTX),which has immunosuppressive and antitumor properties on interferon production and the role of interferon(IFN) in rheumatic autoimmune disease.MethodsCutured Huh7.5.1 cells were treated with different concentration of MTX(5,20,100 μg/mL) for 48 hours.After MTX intervention,the mRNA expression levels of IFN-α,IFN-β,IFN-γ,ISG15,MxA in Huh7.5.1 cells were quantified by real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsCompared with the control group,the endogenous IFN-α,IFN-β mRNA expressions of Huh7.5.1 cells under the intervention of methotrexate(5, 20 μg/mL) were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05),which was increaing with the rise of the concentration of MTX intervention.MTX concentration of 100 μg/mL, compared with the control group,although there was an increase,but without statistical significance(P>0.05).While the mRNA expression of IFN-α was only significantly different when the MTX concentration was 20 μg/mL(P<0.05).Although there was an increase in 5 μg/mL and 100 μg/mL, there was no statistical significance(P>0.05).In MTX, the expression levels of MxA and ISG15 were increased in different degrees(P<0.05).ConclusionThe good efficacy of low-dose MTX in the treatment of rheumatic autoimmune diseases may be related to IFN.

methotrexate;innate immune;interferon

元建國(1955-)，主治醫師，碩士，主要從事風濕免疫研究。△

，E-mail:shilin-li@hotmail.com。▲通訊作者，E-mail:limin_chen_99@yahoo.com。

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.001

R392.1

A

1671-8348(2016)22-3025-03

2016-02-12

2016-03-25)