戊二醛改性明膠耐酶解條件的優化

張單單，白 鴿，王 琳，馮麗萍，魏 冰，曹雁平，，*（.北京工商大學食品學院，北京00048；.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京00048）

戊二醛改性明膠耐酶解條件的優化

張單單1，白 鴿1，王 琳1，馮麗萍1，魏 冰2，曹雁平1，2，*
（1.北京工商大學食品學院，北京100048；2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京100048）

采用明膠為原料，以戊二醛為改性劑，以水解度為指標，通過單因素實驗和均勻實驗設計，研究戊二醛濃度、改性pH、溫度和時間及各因素交互作用對水解度的影響，利用偏最小二乘回歸法建立二次多項式回歸方程，并確定戊二醛改性明膠耐酶解最佳處理條件為：戊二醛濃度0.9%、pH=6.0、改性溫度57℃，改性時間16 min。在該條件下，改性明膠在60 min的水解度為4.35%。在此條件下實際水解度為4.68%，相對誤差約為7.05%。說明建立的預測模型具有一定的實踐指導意義。與未改性明膠相比較，耐酶解能力提高了18.75%。

明膠，改性，戊二醛，水解度

明膠是由膠原部分水解而得到的一類蛋白質，因此明膠具有良好的生物相容性［1］，并具有優良的物理性質如膠凍力、分散穩定性、持水性、成膜性等［2］，明膠形成凝膠后，可以作為風味劑、糖及其他配合物的載體，在食品工業中有廣泛的應用［3］。但明膠易被蛋白酶酶解、機械強度小、易受細菌污染而變質等，通常通過改性來增強明膠的機械強度，調節其降解速率，擴大其應用領域［4］。

戊二醛是常用的明膠改性試劑之一［5］，具有反應活性高、反應快、結合量高、產品穩定等優點［6］。有關戊二醛改性明膠通常是增強明膠機械性能、疏水性能等。例如Bigi等［7］使用1%戊二醛交聯A型明膠，通過X射線衍射儀（XRD）、差示掃描量熱儀（DSC）、溶脹率等手段表征結果表明，戊二醛降低了明膠的吸水性而增大其機械強度。Bigi等［8］通過DSC研究表明，戊二醛交聯使明膠膜的熱穩定性增加，正如變性溫度向更高的值轉移一樣。在抗酶解方面，僅研究了戊二醛改性膠原抗酶解性能，例如單志華等［9］研究當戊二醛用量大于1%，膠原酶水解前后的物性基本不變，證明皮膠原耐酶解能力顯著提高。Thomposn等［10］報道戊二醛交聯膠原膜與未交聯膠原膜比較，高應變模量、抗膠原酶降解能力顯著提高，而膨脹率顯著降低。但戊二醛改性明膠抗酶解方面的研究一直未見報道。

本文以戊二醛改性明膠，采用茚三酮比色法，測定改性明膠水解度，通過單因素和均勻設計實驗，采用偏最小二乘法回歸法處理數據，建立二次多項式回歸方程的預測模型，并確定戊二醛改性明膠最佳優化處理條件，從而提高明膠耐酶解能力，提高材料的穩定性，為工業生產中固定化酶的載體研究提供一種新思路，同時為明膠材料控制釋放理論研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠、25%戊二醛溶液、甘氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、茚三酮、醋酸丁酯 均來自上海國藥集團化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶（測定活力4.96×105U/g） 美國Sigma公司；無水乙醇 分析純，北京化工廠。

CP214電子分析天平 上海市奧豪斯儀器有限公司；DC-2006型低溫恒溫水浴鍋 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；UVmini-1240型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華有限責任公司；FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CT3質構分析儀、LVDV-Ⅱ+Pro型旋轉數顯粘度計 來自美國Brookfield公司；Kjeltec 8400半自動凱氏定氮儀 德國福斯公司。

1.2 實驗內容與方法

1.2.1 明膠濃度的確定 稱取一定質量明膠制成質量濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%的明膠溶液，取一部分用于測定不同濃度下明膠的粘度，另一部分成型后于4℃冰箱中保存，測定其凝膠強度。

1.2.2 不同條件下戊二醛改性明膠球的制備 在

1.2.1 的結果下，取一定質量明膠溶于磷酸鹽緩沖溶液中，60℃恒溫水浴鍋完全溶解，在一定溫度下緩慢滴加不同濃度的戊二醛溶液1 mL，反應后冷卻到室溫，滴加到200 mL不斷攪拌的冷的醋酸丁酯中，通過調節轉速控制球珠的大小（4±1）mm。形成球珠后撈出浸泡在100 mL 0.5%戊二醛溶液中，4℃冰箱儲藏30 min后，水洗三遍，濾干，放置在冰箱中備用［11］。同時以未改性明膠球作對比。

1.2.3 改性明膠水解度單因素實驗 以水解度為實驗指標，固定戊二醛濃度0.7%、戊二醛反應pH=6.0、溫度50℃、時間30 min，通過單因素實驗，研究戊二醛濃度（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、改性pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、溫度（40、45、50、55、60℃）及時間（15、30、45、60、75 min）對改性明膠水解度的影響。

1.2.4 改性明膠水解度均勻實驗 根據上述單因素實驗，選擇戊二醛濃度、改性pH、溫度和時間進行4因素5水平的均勻實驗，分析各因素以及交互作用對水解度的影響，利用偏最小二乘法回歸法處理數據，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，并確定戊二醛改性明膠最佳優化處理條件，均勻實驗因素水平表見表1。

表1 實驗因素水平表Table1 Factors and levels for the trial

1.3 檢測評價方法

1.3.1 水解度（DH）的測定 在三角瓶中加入20倍明膠球重的磷酸鹽緩沖溶液中（pH=7.0），放入4%明膠球重的木瓜蛋白酶，最后加入明膠球，搖勻置于恒溫振蕩器中，保持40℃水浴溫度，每隔30 min取水解液，沸水浴滅酶5 min，共取5個點。采用茚三酮法［12］測定水解液中氨基氮含量，采用凱氏定氮法［13］測定總氮含量。水解度［14］DH（%）計算公式：

式（1）中，Ah—不同時間水解液中的氨基氮含量（μg）；A0—明膠中固有的氨基氮含量（μg）；Az—明膠總氮含量（μg）。

1.3.2 凝膠強度測定 凝膠強度測定采用Bloom法［15-16］，采用CT-3質構儀測定。測定條件為：柱塞P0.5；下壓4 mm，壓力5 g，壓入后速度1 mm/s。測定步驟：將樣品在質構儀圓臺上放平，柱塞對準膠面中心后下壓，記錄最大力。每一個待測樣品作三個平行樣，重復測定2次，取平均值。

1.3.3 粘度測定 采用博勒飛LVDV-Ⅱ+Pro型旋轉數顯粘度計測定［17］。配制不同濃度的明膠溶液置于恒溫水浴鍋中，溫度保持在（65±1）℃的中，每一個待測樣品作三個平行，取平均值。

1.4 數據處理

實驗各值均為3個平行數據的均值，結果表示為“平均值±標準差”。采用DPSv15.10（杭州睿豐信息技術有限公司）數據處理系統進行均勻實驗因素設計。數據統計結果與分析采用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0軟件（美國OriginLab公司）分析。用SPSS 17.0軟件（美國IBM公司）進行方差分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 明膠濃度的確定

表2所示，不同濃度明膠溶液的粘度和凝膠硬度具有顯著性差異（p＜0.05）。明膠溶液粘度越大，戊二醛溶液的滲透能力越弱，不利于醛基與明膠氨基結合，并且凝膠硬度與彈力對包埋介質是否表現出良好的控釋能力起關鍵作用。濃度為20%明膠凝膠硬度顯著提高到1032.07 g，彈力指數0.92，粘度增加到45.50 mPa·s，繼續增加明膠濃度導致溶液過于黏稠，不利于戊二醛溶液的滲透，同時20%明膠成球性較好，綜上因素分析采用濃度為20%的明膠做后續研究。

表2 不同濃度明膠的粘度、硬度與彈性Table2 Viscosity，hardness and elasticity of different concentrations of gelatin

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 戊二醛濃度對水解度的影響 由圖1可知，水解度隨著戊二醛濃度的增加而降低，其中戊二醛濃度0.7%時顯著降低（p＜0.05），水解度達到最低。與未改性明膠相比較，耐酶解能力提高了18.75%。金勛杰［18-19］對不同濃度戊二醛改性明膠的交聯度、溶脹率與降解率方面做了研究，結果表明1%戊二醛濃度時，交聯度已達到很高的程度，濃度超過1%時，各指標變化幅度較小。這與本實驗結果相吻合。這是由于戊二醛濃度的增大，醛基與氨基結合形成的希夫堿結構增多，但戊二醛濃度過大，水解度呈現變大的趨勢。鹿保鑫［20］研究表明戊二醛過量時，交聯位點過飽和，體系分子間相對滑動困難，且易產生局部凝膠現象。正是由于這種局部凝膠現象的出現，導致反應的不完全，抵抗酶水解能力減弱。

圖1 不同濃度戊二醛改性明膠的水解度Fig.1 The degree of hydrolysis of modified gelatin at various concentration of glutaraldehyde

2.2.2 改性pH對水解度的影響 由圖2可知，pH在7.0、7.5水解度比較高，原因可能是在此時明膠與戊二醛反應速度緩慢，而在pH=8.0反應迅速加快，此時的水解度顯著性降低（p＜0.05）。李臨生［6，21］報道戊二醛的反應活性表現在很寬的pH范圍內，這是其他的醛所不能相比的，并且在堿性條件下越容易，而高于9時由于戊二醛本身聚合速度的增加，反應速度反而相對下降。

圖2 不同pH下改性明膠的水解度DH（%）Fig.2 The degree of hydrolysis of modified gelatin at various pH values

圖3 不同改性溫度明膠的水解度Fig.3 Degree of hydrolysis of the modified gelatin at different temperatures

2.2.3 改性溫度對水解度的影響 由圖3可知，戊二醛與明膠反應隨著溫度的升高水解度降低，在50℃時達到最低，并且具有顯著性差異（p＜0.05），這是由于溫度升高，戊二醛與體系大分子間運動加快，而繼續增加反應溫度，水解度逐漸增大，其原因，邱一鳴［22］認為隨著溫度的升高，游離態戊二醛含量增多，同時鄭學晶［23］研究表明高濃度游離醛易縮聚成較長的大分子鏈，水分子易進入與明膠蛋白發生交聯形成長鏈分子的交聯網格中。正是這種網格結構的增多導致抵抗蛋白酶能力減弱，因此，明膠蛋白與戊二醛反應的最佳溫度在50℃左右。

2.2.4 改性時間對水解度的影響 由圖4可知，隨著改性時間的延長水解度先降低再升高，改性時間在60 min時水解度顯著性降低（p＜0.05），并達到最低，林海莉［24］解釋為正是反應時間的延長增強了戊二醛與明膠分子上氨基的接觸機會，使反應趨向更加充分，形成了較為致密的交聯網狀結構。當繼續延長反應時間，水解度反而升高，李臨生［21］報道有人認為戊二醛與伯氨基反應是一個可逆的過程，生成物不穩定。

2.3 均勻實驗的結果

圖4 不同改性時間的明膠水解度Fig.4 Degree of hydrolysis of the modified gelatin at different times

表3 均勻實驗結果Table3 The results of uniform design

采用偏最小二乘回歸分析方法對實驗結果分析。以戊二醛濃度、改性pH、溫度和時間為因變量，借助DPS15.10數據處理系統軟件來建立二次多項式回歸模型：Y=14.8799351-5.109605X1-0.712393X2-0.244869X3+0.024949X4-0.071656X-0.013488X+0.000108X+0.000077X+0.530187X1X2+0.029836X1X3- 0.001770X1X4+0.023132X2X3-0.009468X2X4+0.000770X3X4

根據數據處理系統所得出的實驗處理結果給出了最優指標時各個因素組合，為了驗證偏最小二乘回歸方程以及實驗的可信程度，因此安排一次驗證實驗，測得各性能指標，如表4所示。

表4 最優指標時各個因素組合與目標函數Table4 Each factor combination and objective function of the optimal index

數據標準化后計算相關系數：誤差平方和：0.6035；決定系數R2：0.9329；PRESS統計量：6.4965。說明該模型與實際實驗擬合較好，方程在給定的實驗范圍內有較高的可信度，可用于實際預測。PLS偏最小二乘法回歸系數分析各因素對水解度的影響程度大小的順序為：X3（改性pH）＞X4（時間）＞X2（溫度）＞X1（戊二醛濃度）。經擬合得到最佳處理條件為：戊二醛濃度0.9%、pH=6.0、57℃下改性16 min，改性明膠在水解60 min的水解度為4.35%。驗證實驗證明最佳的戊二醛改性明膠條件下水解度為4.68%，相對誤差為7.05%。對比運用數據處理系統所得出來的預測值和進行優化實驗的實測值，可以說明偏最小二乘二次回歸所建立的二次回歸模型是可信的，所建立的模型的優化預測成立。

最優條件戊二醛改性膠的水解度為4.68%，與2.2.1中的未改性明膠的水解度（5.56%）相比，耐酶解能力提高了18.75%。

3 結論與討論

本實驗在單因素實驗基礎上，運用均勻實驗設計軟件，得到最佳處理條件：戊二醛濃度為0.9%，pH=6.0，57℃下改性16 min，改性明膠在水解60 min的水解度為4.35%。驗證實驗證明在此條件下實際水解度為4.68%，相對誤差為7.05%。說明經偏最小二乘二次回歸所建立的二次回歸模型是可信的，所建立的模型的優化預測是成立。與未改性明膠相比較，耐酶解能力提高了18.75%。

戊二醛與明膠蛋白之間的作用受明膠種類、戊二醛濃度、反應pH、溫度、時間、反應體系等多種因素影響，本實驗采用制球方式，所以水解度的測定結果受球的直徑影響較大，因此實驗中一定要控制球珠大小在4 mm左右。戊二醛與明膠蛋白之間的改性程度越大，改性后的明膠抗酶解能力顯著增強，王詠梅等［25］采用戊二醛、光、熱交聯三種交聯固化方法研究明膠微球包埋hEGF體外釋放能力，結果證明：交聯程度與體外釋放規律密切相關，通過控制交聯度可以控制載體的降解速率，從而有效延緩載體的降解速率和包埋介質的釋放速度。但是戊二醛與明膠之間的作用機理及產物結構方面存在很大的研究空間，有待于進一步研究。

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Optimizing conditions of the modified gelatin with glutaraldehyde resistant to enzymatic hydrolysis

ZHANG Dan-dan1，BAI Ge1，WANG Lin1，FENG Li-ping1，WEI Bing2，CAO Yan-ping1，2，*
（1.College of Food Science，Beijing Technology and Business Univerisity，Beijing 100048，China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China）

Using gelatin as raw material，glutaraldehyde as the modifier，the degree of hydrolysis was studied by single factor test and uniform design.The effects of glutaraldehyde concentration，pH，reaction temperature，time and the interactions of above factors on the degree of hydrolysis were studied.The prediction model of two polynomial regression equation was obtained by using the method of partial least squares regression.The optimal treatment conditions for the enzymatic hydrolysis of glutaraldehyde modified gelatin were as follows：the concentration of glutaraldehyde was 0.9%，pH value was 6.0，the temperature was 60℃and the modified time was 16 min，under which the hydrolysis degree of modified gelatin in 60 min was 4.35%.Results showed that the hydrolysis degree was 4.68%with a relative error of 7.05%by the experiment compare with the above fitting result.Results indicated that the regression equation obtained by the partial least squares regression optimization could guide practical to some extent.Compared with the non-modified gelatin，the anti-enzyme hydrolysis ability of modified gelatin was increased by 18.75%.

gelatin；modified；glutaraldehyde；degree of hydrolysis

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0133-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.018

2015－09－29

張單單（1989-），女，碩士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：laisui0911@126.com。

曹雁平（1961-），男，博士，教授，研究方向：食品化學與安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學基金項目（31371722）。