鹽酸法舒地爾對大鼠主動脈球囊損傷后血管內膜及IL-8、TGF-β1的影響

周中興，潘娜娜，譚麗娟（青島大學醫學院附屬醫院黃島院區心內科，山東 青島 266003）

鹽酸法舒地爾對大鼠主動脈球囊損傷后血管內膜及IL-8、TGF-β1的影響

周中興，潘娜娜，譚麗娟
（青島大學醫學院附屬醫院黃島院區心內科，山東 青島 266003）

目的 探討鹽酸法舒地對大鼠主動脈球囊損傷術后血管內膜增生的影響，并測定血清中IL-8、TGF-β1濃度及TGF-β1在血管內皮細胞和平滑肌細胞的表達情況。方法 選取SD大鼠40只，隨機分為對照組8只、手術組16只、藥物組16只，手術組和藥物組給予左頸動脈切口，并2 F球囊導管插管行主動脈內膜損傷，手術組給予NS（0.5 ml/100 g/bid），藥物組給予鹽酸法舒地（0.5 mg/100 g/bid）腹腔注射，分別于損傷后14天、28天取大鼠主動脈血管標本，HE染色觀察各組增殖血管內膜形態學變化，并測量新生內膜面積（IA）、中膜面積（MA）、內膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、內膜面積/中膜面積比值（IA/MA），觀察大鼠血管內皮損傷后內膜增生情況。并用ELISA法檢測血清中IL-8、TGF-β1的濃度，并免疫組化檢測TGF-β1在損傷后血管新生內膜及中膜的表達情況。結果 對照組血管內膜為扁平的內皮細胞，中層為梭形平滑肌細胞的排列，內膜光滑，未見平滑肌細胞增生及增殖情況。手術組球囊損傷后14天內膜增生明顯，其IA、MA、IT、MT、IA/MA顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），至28天內膜繼續增生。藥物組在14天內膜增生明顯，內膜及中膜面積及厚度的測量值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。28天后藥物組內膜增厚較14天時減少，差異有統計學意義（P＜0.05），與手術組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。至14天時兩損傷組IL-8、TGF-β1在血漿中檢測出，而藥物組14天時血漿中可檢測到IL-8、TGF-β1相比手術組減少，差異有統計學意義（P＜0.05），至28天時手術組仍可檢測到IL-8、TGF-β1較14天時減少。至28天藥物組上述血清中的濃度較14天時減少，差異有統計學意義（P＜0.05），與手術組相比減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。并14天時藥物組TGF-β1在新生內膜及中膜可見表達，與模型組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），而28天時表達量相比模型組減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 鹽酸法舒地可有效抑制大鼠主動脈球囊損傷術后主動脈內膜的增生及增殖，從而減少管腔面積的丟失，可能與其抑制早期炎癥因子IL-8及轉化生長因子-β1的表達有關。

鹽酸法舒地；球囊損傷；動脈內膜；IL-8；TGF-β1

隨著經皮冠狀動脈血管成形術的廣泛開展，不僅降低了冠心病，特別是急性心肌梗死患者的近期死亡率，而且改善了長期預后。而術后再狹窄的發生率嚴重影響了其遠期療效，多數研究認為術后的炎癥反應及中膜平滑肌細胞的遷移、增殖不僅參與了早期血栓事件的發生，更是參與了后期血管病理性重構和慢性縮窄的過程［1］。雖然冠狀動脈支架植入術可以抑制動脈血管的彈性回縮，改善血管壁的重塑，從而使再狹窄率降低，但另一方面它卻有增加血管壁損傷和血栓形成的危險，尤其是血管內皮的損傷進一步加重了炎癥反應，纖維層的斷裂導致血管壁中層平滑肌細胞過度增殖并向內膜遷移，血管新生內膜形成導致再狹窄。因此早期抑制炎癥反應及中膜的病理性重構、重塑過程成為預防術后再狹窄的有效措施。IL-8是早期炎癥反應所釋放的重要因子，轉化生長因子β1是一組新近發現的調節細胞生長、分化、免疫的TGF-β超家族，是多種細胞損傷后早期表型轉化及增殖的始動因子。Rho激酶為Rho蛋白下游作用底物，主要發揮信息傳導和分子開關作用。最早應用于蛛網膜下腔出血引起的腦血管痙攣，改善局部腦動脈循環的功能，而其在心血管領域的應用得到廣泛證實，特別是在冠狀動脈痙攣、心肌梗死、再狹窄、心力衰竭方面［2］。本文通過鹽酸法舒地尓對于大鼠主動脈球囊損傷術后主動脈內膜增殖及對IL-8、TGF-β1表達的影響，旨在探討法舒地尓防治血管再狹窄的可能機制。

1　材料與方法

1.1材料

健康雄性SD大鼠40只，體質量（400±50）g購自青島市動物實驗中心。鹽酸法舒地尓（天津紅日制藥，30 mg/2 mL）；2.0 F自制球囊導管；高清彩色像分析系統（HPIA2000）（美國Beckman Coulter公司）；表達的免疫組化染色檢測試劑盒（北京碧云天生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及實驗分組

40只SD大鼠分為3組：正常對照組（n=8）；手術組（主動脈球囊損傷術+腹腔注射NS 0.5 ml/100 g/Bid，n=16）；法舒地尓組（HF球囊損傷+腹腔注射鹽酸法舒地尓0.5 mg/100 g/Bid，n=16）。

1.2.2大鼠主動脈內膜損傷模型的建立

將大鼠用將大鼠以3%的水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，做頸部長約2 cm正中切口，鈍性分離左側頸總動脈，遠心端用絲線結扎，近心端用無創動脈夾夾閉，在兩端間剪一小口，從切口向近心端緩慢插入球囊導管（2 F，球囊長度2 cm），深度約10～12 cm至髂動脈分叉處，以0.15～0.2 mL生理鹽水充盈球囊，回拉球囊并旋轉導管至左頸總動脈分叉處，反復抽拉6次以確保充分剝脫內皮，拔出球囊導管，結扎血管，逐層縫合切口，術后3天給予青霉素20萬IU/100 g腹腔注射，并常規飼養至處死，采用HE免疫組化染色，光鏡觀察球囊損傷大鼠頸動脈使動脈血管內膜剝脫，判斷模型建立成功。

1.2.3增殖血管內膜面積測定

分別于球囊損傷后14天、28天取對照組4只及損傷組各6只大鼠腹腔注射過量的水合氯醛，左側腹部切口5～7 cm，鈍性分離并游離主動脈，腎動脈分叉處逆行分離至主動脈根部，插管用生理鹽水灌洗胸腹主動脈。留取主動脈標本組織2 cm左右，用4%中性多聚甲醛溶液固定24 h的主動脈組織標本，常規按石蠟切片制作程序（固定、脫水、透明及包埋處理），然后切片脫蠟后，進行HE染色。隨機選取5個視野，光鏡下觀察新生內膜增生情況，圖像分析系統測定IA、MA、MA、IT、IA/MA。

1.2.4酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清IL-8、TGF-β1濃度

分別于術后14天、28天，制取主動脈組織前，大鼠摘除眼球取血（采集前動物禁飲食8 h），送本院檢驗科，ELISA法測定血漿中IL-8、TGF-β1的濃度，具體操作步驟按照ELISA檢測試劑盒的說明書進行。

1.3統計學處理

以SPSS 17.0統計軟件包進行統計分析。計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結 果

2.1主動脈標本組織病理學形態及定量分析

手術組及藥物組（HF）在術中及術后有2只大鼠死亡，考慮與術中動脈夾層、麻醉藥過量及術后長期腹腔注射，大鼠長期處于應激狀態，導致進食減少引起。各組主動脈標本組織病理學見圖1、圖2、圖3。14天后手術組及HF組大鼠主動脈內膜增生明顯，其IA、MA、MA、IT、IA/MA相比于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。手術組與HF組之間，差異無統計學意義（P＞0.05）。至28天時手術組內膜繼續增生，藥物組IA、MA、MA、IT、IA/MA指標的改善相比14天時，差異有統計學意義（P＜0.05），與手術組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2酶聯免疫吸附法（ELISA）

14天后血清中IL-8、TGF-β1在手術組及HF組可檢測出。IL-8在HF組血漿中少于手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）。至28天血清中IL-8在HF組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；TGF-β1在手術組仍持續檢測出，見表2。

圖1　內膜HF染色×100倍

圖2　內膜HF染色×100倍

圖3　內膜HF染色×400倍

表1　各組大鼠主動脈內膜增生情況定量分析（±s，mm/mm）

表1　各組大鼠主動脈內膜增生情況定量分析（±s，mm/mm）

注：*與對照組相比，P＜0.05；#與手術組相比，P＜0.05；θ與對照組相比，P＞0.05

對照組　　手術組　HF組14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d （IA）　0.96±0.12　0.99±0.10　2.41±1.21*　4.32±1.15**　2.23±0.77*#　1.25±0.46αβ（MA）　2.53±0.54　2.61±0.34　4.12±1.02*　6.18±1.42**　3.71±1.12*#　3.55±1.04αβ（MT）　1.43±0.14　1.41±0.23　1.98±1.33*　2.26±0.57**　1.76±0.57*#　1.59±0.23αβ（IT）　0.45±0.07　0.53±0.10　1.23±1.42*　1.56±0.38**　1.16±0.26*#　0.64±0.12αβ（IA/MA）　36.97±4.06　34.38±3.76　58.49±5.18*　69.90±3.13**　60.10±2.08**　35.21±3.53αβ注：與對照組相比，*P＜0.05；與對照組相比，**P＜0.01；與手術組相比，#P＞0.05；與手術組相比，αP＜0.01；與14天相比，βP＜0.05 表2 IL-8、TGF-β1在三組動物血漿中濃度的定量檢測（x±s）對照組　　手術組　HF組14 d　28 d　14 d　28 d　14 d　28 d IL-8（μg/L）　63.24±8.25　58.91±11.17　135.87±22.25*　149.28±28.61*　127.33±19.32*　70.59±9.24#θ TGF-β1（ng/L）　12.03±2.63　13.84±2.95　18.48±4.67*　21.62±5.33*　17.66±5.66*　13.14±3.11#θ

3　討 論

彌漫性的血管內皮功能障礙參與了冠心病的發生、發展的全過程［3］，特別對于急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome ACS）。PTCA及支架植入術雖可迅速改善患者的冠狀動脈血供，緩解癥狀，但術后誘發的血管壁損傷和炎癥反應［4］，將加速病變的進展。目前認為冠狀動脈支架置入對動脈壁損傷導致血管內皮細胞損傷，血小板聚集，促進炎癥的發生，加重了病變部位的內皮功能損害。炎性細胞和內皮細胞及血小板又可釋放大量的細胞因子促使血管平滑肌增殖和遷移，影響患者遠期預后［5］。本實驗中球囊損傷術后14天主動脈內膜鏡下面積、中膜面積、內膜厚度、中膜厚度、內膜面積/中膜面積相比對照組增加顯著，從而導致管腔面積的早期丟失。至28天時鏡下觀察到手術組內膜面積持續丟失，病理性重塑機制導致管腔進一步狹窄，與既往研究一致。

Rho激酶是最早發現、也是目前研究較為清楚的一個小G蛋白RhoA的下游效應器。以兩種同源性極高的異構體存在：ROCKI（ROCKα炎癥反應過程）和ROCKII（ROCKβ血管平滑肌細胞）。ROCK的激活可在分子及細胞水平參與血管損傷后的炎癥反應及內膜的增生、增殖過程。ROCK的激活可使一氧化氮合酶的表達下調，內皮細胞來源的NO在調節血管張力、抑制血小板聚集、平滑肌細胞增殖和防止白細胞向血管壁的粘附等過程中發揮重要作用。法舒地爾（fasudil，Fas）是第一個也是惟一應用于臨床的Rho激酶抑制劑，主要用于治療蛛網膜下腔出血所致的腦血管痙攣及相關的神經系統缺血癥狀。在許多已開展的臨床前期研究中，發現法舒地爾對包括冠狀動脈痙攣、高血壓、肺動脈高壓、冠脈再通手術后的再狹窄和AS在內的多種心血管疾病均有良好的治療作用和較高的安全性。研究證實，IL-8在心血管介入手術后無菌性炎癥反應中參與了眾多細胞因子的激活及趨化，是冠脈介入術后心臟事件強有力的預測因子［6］。本研究表明大鼠主動脈球囊損傷后血清中早期炎癥反應的發生，并測得早期應用法舒地尓可有效抑制早期炎癥反應的程度，減輕血管內膜內皮的損傷，并進一步抑制后續炎癥反應的進程，可能是其預防術后急性血栓事件及再狹窄的機制之一。

綜上所述，鹽酸法舒地尓（hydroxy fasudil HF）可有效抑制主動脈損傷術后管腔面積的丟失，預防術后再狹窄的發生［7］，而抑制早期炎癥因子IL-8及TGF-β1的產生與表達可能是其機制之一。究其分子機制及長期用藥效果還有待進一步研究，但可為冠脈介入治療術后再狹窄的防治提供新的依據，使鹽酸法舒地尓的臨床應用范圍更加廣泛。

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本文編輯：孫春宇

R285.5

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ISSN.2095-6681.2016.08.078.04