外加鎘處理下生物質炭對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

張秀，尚藝婕，夏運生，趙青青，史靜

（云南農業大學資源與環境學院，昆明650201）

外加鎘處理下生物質炭對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響

張秀，尚藝婕，夏運生，趙青青，史靜*

（云南農業大學資源與環境學院，昆明650201）

采用Biolog-Eco微平板法，通過模擬實驗探究外源Cd脅迫下不同量（0%、2.5%、10%，W/W）秸稈生物質炭輸入后土壤微生物在碳代謝功能方面的響應機制。平均吸光度（AWCD）值、多樣性指數、碳源利用特征和主成分分析結果均表明：Cd污染條件下，生物質炭的施用提高了土壤中微生物群落碳源代謝活性及功能多樣性，2.5%生物質炭處理下的提高效果尤為顯著。土壤微生物McIntosh指數上升了70.59%，群落物種均一度發生巨大的變化；土壤微生物對羧酸類、氨基酸類碳源化合物的利用能力分別提高了10倍和5倍，其中2.5%低質量分數生物質炭提高了土壤微生物對羧酸類和糖類碳源化合物利用率，10%高質量分數生物質炭卻提高了氨基酸類碳源化合物的利用率。進一步分析顯示，羧酸類、其他類和聚合物類碳源化合物促使兩個生物質炭處理組與單加Cd對照組在碳源利用率上存在差異。

生物質炭；重金屬；Cd；微生物功能多樣性；Biolog

張秀，尚藝婕，夏運生，等.外加鎘處理下生物質炭對土壤微生物碳代謝功能多樣性的影響［J］.農業環境科學學報，2016，35（7）:1308-1313.

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近年來，重金屬Cd污染形勢嚴峻［1-2］，它因具有半衰期長、移動性強、生物毒性大等特點，對生態環境、工農業生產、食品安全和人類健康等均造成一系列負面影響。大量的研究指出重金屬對土壤微生物具有脅迫毒害作用，主要表現為土壤微生物的數量、活性、群落結構及多樣性等的降低［3-5］。而土壤微生物是反映土壤生態系統安全和土壤物質能量循環的敏感性生物指標之一［6］，它可衡量土壤質量和肥力，評價土壤生態系統的可持續性。生物質炭能通過吸附、絡合、螯合、氧化還原等方式固定土壤中的重金屬，降低其在土壤中遷移轉化速率。國外有研究報道土壤中施入生物質炭后，Cd濃度下降為原先的1/10，Cd的生物有效性也顯著降低［7］。生物質炭能為土壤微生物生長繁殖提供充足的養分，可作為微生物棲息的微環境，避免微生物間的競爭［8］。研究表明，玉米秸稈、水稻秸稈兩種生物質炭添加到土壤后均可以增加革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、放線菌和真菌的含量，改變土壤的微生物群落結構［9］。生物質炭對土壤重金屬污染良好的修復效應以及對土壤中微生物的保護效應得到了國內外學者的一致肯定。現今重金屬Cd和生物質炭雙重作用機制下土壤微生物變化趨勢及規律的研究卻鮮有報道，且影響機制尚不明確。本文通過外源Cd污染條件下不同量生物質炭對土壤微生物功能多樣性的影響機制及作用原理的研究，旨在揭示生物質炭提升土壤微生物功能多樣性是否可作為其修復重金屬污染土壤的機制之一，以期為生物質炭在該領域的科學應用提供一個微生態的新思路。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用土壤為云南農業大學后山的紅壤，基本理化性質詳見表1。

表1　供試土壤理化性質Table 1 Physical and chemical characteristics of soil

選取河南三利公司生產的商品秸稈生物質炭，基本理化性質詳見表2。

1.2實驗設計

實驗為盆栽模擬實驗，選用普通塑料桶，每桶裝8 kg土。配制不同濃度的CdCl2母液，與土壤混合均勻。秸稈生物質炭按照0%、2.5%、10%的質量比添加到上述混勻土壤中（因在前期實驗中5%生物質炭添加量下Cd形態、土壤酶活性沒有明顯變化，所以本實驗不是按照梯度設置生物質炭添加量，而是選取了變化顯著的2.5%、10%生物質炭添加量），并設置無任何添加的空白對照組，共4種處理：Cd添加量為0 mg·kg-1，生物質炭添加量為0%（CK）；Cd添加量為2.5 mg·kg-1，生物質炭添加量為0%（B0）；Cd添加量為2.5 mg·kg-1，生物質炭添加量為2.5%（B2.5）；Cd添加量為2.5 mg·kg-1，生物質炭添加量為10%（B10）。每種處理設置3個平行對照組，置于溫室大棚中并種植水稻，保持土壤濕度至田間持水量的70%，待水稻生長到分蘗期時采集（五點法）各處理土壤，進行功能多樣性測定。

表2　生物質炭理化性質Table 2 Physical and chemical characteristics of biochar

1.3土壤微生物群落功能多樣性測定方法

本研究采用Biolog-ECO板分析土壤微生物群落的代謝功能特征。ECO板所用接種液的制備采用Classen等［10］的方法。稱取相當于5 g烘干質量的新鮮土樣置于無菌三角瓶中，加入45 mL濃度為0.85%的無菌生理鹽水，200 r·min-1振蕩30 min后靜置15 min，取5 mL上清液置于裝有45 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，重復稀釋3次，制得1：1000的接種液。將ECO板提前預熱到25℃，用八道移液槍取150 μL接種液于每孔中。ECO板置于恒溫培養箱中，25℃左右避光培養7 d，分別于4、24、48、96、120、144、168 h用Biolog微生物自動鑒定系統讀取590 nm處吸光值，每板重復讀數3次。

1.4數據處理

本文采用微平板每孔顏色平均變化率（Average Well Color Development，AWCD）描述土壤微生物整體活性。采用Shannon指數、Simpson指數與McIntosh指數表征土壤微生物群落功能多樣性。實驗數據的方差分析和主成分分析均用SPSS 19軟件完成，Excel 2007繪圖。具體數據處理公式詳見表3。

2　結果與分析

2.1不同處理下土壤微生物群落活性的變化

AWCD表征微生物群落對碳源的利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的重要指標之一，反映了土壤微生物活性、微生物群落生理功能多樣性［11］。不同處理土樣利用31種碳源的總AWCD變化趨勢如圖1所示。從整體上看，4種處理下AWCD值均隨著培養時間的延長而增加，4～24 h內增長緩慢，碳源基本未被利用，24～120 h內快速增長變化明顯，碳源被大幅利用，120 h以后增長趨于平緩。這表明，土壤微生物整體代謝活性與培養時間呈正相關關系，在24～120 h碳源利用能力最強，微生物代謝活性最高。具體來看4個處理在整個培養過程中有明顯差異，土壤微生物的碳源利用能力4～72 h時間段內依次為B2.5＞B10＞B0＞CK，72 h后為B2.5＞B10＞CK＞B0。可見，添加生物質炭處理的土壤微生物代謝活性遠遠高于未添加生物質炭的兩個處理，尤其是B2.5處理組對土壤微生物代謝活性影響最為顯著；單加Cd的B0處理組72 h之前AWCD值呈上升趨勢，微生物碳源利用能力高于CK對照組，但72 h后AWCD值表現為下降趨勢，碳源利用能力低于CK對照組，即B0處理組微生物代謝活性隨時間推移逐漸降低。

表3　文中各數據處理公式Table 3 Formulas for index calculation

2.2不同處理下土壤微生物多樣性指數的變化

圖1　培養期內土壤微生物AWCD值的變化Figure 1 AWCD changes of soil microbial community during incubation

Shannon多樣性指數是研究群落物種豐富度的綜合指標，是目前應用最為廣泛的群落多樣性指數之一，Simpson指數較多反映了群落中最常見的物種優勢度，McIntosh指數則是群落中物種均一性的度量［12］。文中基于培養時間段內AWCD值較穩定的120 h數據，利用3種多樣性指數來分析土壤微生物群落的功能多樣性，分析結果詳見表4。Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數值均呈現B2.5＞B10＞CK＞B0的規律。表明土壤微生物群落功能多樣性在Cd脅迫下降低，生物質炭輸入后對土壤微生物的功能多樣性具有提升作用，B2.5處理下作用效果尤為突出。添加生物質炭兩處理組與單加Cd的B0對照組相比，McIntosh指數上升70.59%，Shannon指數上升27.65%，Simpson指數僅上升8.82%。生物質炭使Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度發生了顯著變化，群落物種的豐富度得到一定的提升，但對群落中常見的微生物物種影響甚微。

表4　4種處理下土壤微生物群落功能多樣性Table 4 Diversity and evenness indices of soil microbial community in different treatments

2.3不同處理下土壤微生物碳源利用特征變化和主成分分析

2.3.1土壤微生物對六類化合物利用變化

根據ECO板上31種碳源的結構與化學性質，將其分為6大類碳源化合物［13］：糖類7種；羧酸類9種；胺類2種；氨基酸類6種；聚合物類4種；其他類3種。對培養120 h六類碳源化合物的AWCD值進行分析，結果如圖2所示。4個處理在碳源代謝方面的優勢群落從大到小依次為其他類、糖類、胺類、聚合物類、氨基酸類、羧酸類，其中：糖類B2.5＞B10＞CK＞B0；羧酸類B2.5＞CK＞B10＞B0；胺類B2.5＞B10＞CK＞B0；氨基酸類B10＞CK＞B2.5＞B0；聚合物類B2.5＞B0＞CK＞B10；其他類B2.5＞B0＞CK＞B10。可見，除氨基酸類化合物B10處理組利用能力最強外，其余五類化合物均是B2.5處理組的利用能力最強，表明Cd污染條件下，4種處理微生物對六類碳源化合物的利用強度差異顯著，碳源利用率與生物質炭添加量沒有直接的線性關系。這跟土壤微生物AWCD值、功能多樣性指數分析結果一致。添加生物質炭兩個處理組與單施Cd的對照組相比，羧酸類的利用能力提高了10倍，氨基酸的利用能力提高了5倍，糖類的利用能力提高了3倍，胺類的利用能力提高了2倍，聚合物類和其他類僅提升了1倍。這表明生物質炭輸入Cd脅迫下土壤微生物對羧酸類、氨基酸類、糖類、胺類四類碳源化合物利用能力增強，但對聚合物類、其他類的利用能力無顯著變化。從相反角度來看，Cd污染促進了土壤微生物對聚合物類和其他類兩類化合物的利用。

圖2　土壤微生物對六類化合物的利用率Figure 2 Utilization rates of six kinds of compounds by soil microbial community

2.3.2土壤微生物利用六類化合物特征的主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）是采取降維的方法，使用少數相互無關的綜合指標反映原統計數據中所包含的絕大多數信息。它能夠將多維數據的差異反映在二維坐標圖上，進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。樣品的群落碳源利用能力越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。為進一步了解不同處理下土壤微生物對不同類型碳源利用能力的差異，對各處理在培養120 h的六類碳源化合物進行了主成分分析。

如圖3所示，4種處理在PC軸上出現了明顯的分異，B2.5位于第一象限，B10和CK都位于第二象限距離較近，B0則位于第三象限，與其余3個處理組的距離較遠。由此可見，B10與CK兩個處理組群落碳源利用能力相似，表明土壤遭受重金屬Cd污染后土壤微生物碳源利用能力減弱，2.5%的生物質炭添加量碳源利用能力最強，而生物質炭添加量10%土壤微生物的群落碳源利用率基本沒有變化。由圖4可知，對PC1貢獻大的碳源化合物（系數＞0.8）有3類，分別是羧酸類、聚合物類和其他類。對PC2貢獻大的碳源化合物只有氨基酸這1種。由于PC1和PC2分別占微生物群落碳源利用率總變異的63.19%和22.47%，PC1是變異的主要來源。因此，對生物質炭處理組與單加Cd對照組起區分作用的主要是羧酸類、聚合物類和其他類三大碳源群落。

圖3　四種處理下土壤微生物六類化合物利用特征主成分分析Figure 3 Principal component analysis of utilization of six kinds of compounds by soil microbial community

圖4　六類化合物在第一、第二主成分的載荷分布Figure 4 Loadings of six kinds of compounds for first and second PCs

3　討論

有研究表明，重金屬污染條件下改良劑-植物聯合修復可改善土壤微生物群落代謝功能多樣性［14］。本研究也表明，在重金屬Cd污染條件下生物質炭輸入后土壤微生物功能多樣性提高。生物質炭中所含有機碳大部分是穩定的，僅有少部分可被土壤微生物分解利用［15］，因而生物質炭通過兩個途徑影響Cd污染條件下土壤微生物的功能多樣性：一方面，生物質炭除C外，還含有N、P、K、Ca、Mg等營養元素，成為土壤微生物生長繁殖的養分來源，生物質炭具有的巨大比表面積和孔隙結構等獨特的性質為土壤微生物提供了生活、棲息的場所，直接影響了土壤微生物功能多樣性；另一方面，本研究中的土壤為酸性紅壤，較貧瘠，生物質炭呈堿性，含有大量養分元素和官能團可改善土壤理化性質，從而吸附固持土壤中重金屬Cd，降低Cd的微生物有效性，間接影響土壤微生物的功能多樣性。彭芳芳等［16］、華建峰等［17］、張宇寧等［18］研究均顯示，土壤微生物的代謝多樣性與土壤有機質、N、P、K含量、pH值等呈極顯著正相關性。王鶴等［19］試驗證明了生物質炭可以通過提高土壤pH值和有機質含量來促進有效態鉛向其他形態轉化，從而降低土壤中鉛的生物有效性。在本研究中，生物質炭對土壤微生物功能多樣性的提升作用并未隨生物質炭增加而提高，可能是由于2.5%低質量分數生物質炭與10%高質量分數生物質炭相比，能更有效地改善土壤理化性質，降低Cd的微生物有效性。可見，生物質炭的添加量是制約Cd污染條件下土壤中微生物功能多樣性變化的一個關鍵因素。當然土壤微生物多樣性變化是多因素相互作用的結果，它也許還與生物質炭性質、土壤中酶活性、土壤類型、植被情況、背景重金屬等相關。

本研究表明，Cd脅迫下土壤微生物代謝活性、多樣性指數、特別幾類碳源化合物利用率均降低，滕應等［20］很早便研究證實重金屬污染引起了土壤微生物群落功能多樣性的下降。生物質炭施入后緩解了Cd的脅迫作用，土壤微生物的功能多樣性提升。各多樣性指數分析可知，生物質炭使Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度發生了顯著變化，但群落中常見的微生物物種優勢度基本無變化。張仕穎等［21］研究顯示，施用丁草胺后Simpson指數越高，土壤微生物的碳源利用能力越集中，多樣性越低。研究中Simpson指數基本無變化，微生物對碳源利用能力均一，微生物分布均勻所以微生物均一度指數高。六類碳源化合物主成分分析顯示，對4個處理起分異作用的碳源化合物主要是羧酸類、聚合物類和其他類。陳琳等［22］研究結果表明重金屬污染抑制了微生物的代謝活性，尤其體現在對糖類和羧酸類碳源的利用上，與本文結果較為一致。本文中起區分作用的碳源化合物存在差別，可能是重金屬Cd污染土壤中外加生物質炭所致。六類碳源化合物具體利用狀況分析表明，Cd可刺激土壤微生物提高對聚合物類、其他類兩類化合物的利用能力。有研究表明，中低濃度有機氯農藥可能促進土壤中微生物對胺/氨基化合物的利用，高濃度則產生抑制作用［23］。本實驗外源Cd的添加量為2.5 mg· kg-1，模擬的是中低濃度Cd污染條件。中低濃度污染可能會刺激土壤微生物中耐Cd的優勢菌群產生，而且這些優勢菌群對聚合物類、其他類碳源具有偏嗜性，導致這兩類碳源化合物的利用率提高。Coppotellil等［24］也認為污染脅迫會改變土壤微生物群落結構，形成較為適應污染土壤的優勢菌群。B10處理對氨基酸類碳源化合物利用能力增強，B2.5處理組卻對除此之外的五類碳源化合物利用能力均增強，尤其是羧酸類和糖類增強效果最顯著。由此可知，2.5%低質量分數生物質炭可提高土壤微生物對羧酸類、糖類碳源化合物的利用率；10%高質量分數則可提高土壤微生物對氨基酸類碳源化合物的利用率。這表明在Cd污染條件下，土壤微生物在功能多樣性上對不同量生物質炭響應機制錯綜復雜，故有必要對其機制進一步深入探究。

4　結論

（1）Cd污染導致土壤微生物代謝功能多樣性降低，生物質炭的施入緩解了Cd的脅迫作用，但這種緩解作用與生物質炭添加量并無直接的線性關系。AWCD值、功能多樣性指數、各碳源利用率最高均在2.5%生物質炭量條件下，表明此生物質炭量對Cd污染土壤中微生物具有保護作用。

（2）Cd污染條件下，生物質炭輸入后土壤微生物各群落物種均一度發生了顯著變化，群落豐富度增加，群落常見物種優勢度基本無變化。

（3）2.5 mg·kg-1低濃度Cd污染條件下，土壤微生物對聚合物類、其他類兩個類群碳源具有偏嗜性，而羧酸類、氨基酸類兩個碳源類群對生物質炭的反應最靈敏。添加外源生物質炭的Cd污染土壤中微生物對羧酸類、氨基酸類碳源利用能力分別提高10倍和5倍。2.5%低質量分數生物質炭可提高土壤微生物對羧酸類、糖類碳源類群的利用率；10%高質量分數的則可提高土壤微生物對氨基酸類碳源類群的利用率。

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Effects of biochar on carbon metabolic capacity and functional diversity of soil microbial communities under Cd contamination

ZHANG Xiu，SHANG Yi-jie，XIA Yun-sheng，ZHAO Qing-qing，SHI Jing*
（College of Resources and Environment，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

Cadmium（Cd）contamination in farmland ecosystems has become more and more serious.Biochar（BC）are known to bind heavy metals.Whether BC affects the functional diversity of soil microbial communities in Cd-contaminated soil is unclear.Here a pot experiment was designed to investigate the effects of BC on carbon metabolic capacity and functional diversity of soil microbial communities in Cd contaminated soil，using Biolog-Eco micro plate.Application rates of BC were 0%，2.5%，and 10%（W/W）.The AWCD（average well color development）values，diversity index，carbon source utilization characteristics，and the principal component analysis results all showed that though the degree to which the soil microbes in four treatments used carbon sources was different，applying BC generally improved carbon metabolic activity and functional diversity of microbial communities in Cd contaminated soil，with 2.5%BC having the greatest effects. Compared with the control，McIntosh index of soil microbes was increased by 70.59%and the uniform degree of the species in the coenosis experienced huge changes.The utilization ability of carboxylic acid and amino acid carbon source compounds was increased by 10 times and 5 times，respectively.However，such utilization ability of carboxylic acid and saccharide carbon source compounds was increased at low rates of BCs（2.5%）；while that of amino acid carbon source compounds was elevated at high concentration of BCs（10%）.The difference between two BC treatment groups and the control treatment group was mainly caused by carboxylic acid，polymer and other carbon source compounds.

biochar；heavy metal；Cd；microbial functional diversity；Biolog

S154.3

A

1672-2043（2016）07-1308-06

10.11654/jaes.2016.07.012

2015-12-28

云南省應用基礎研究計劃項目（2013FB043）；國家自然科學基金項目（41301349）

張秀（1991—），女，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向為土壤重金屬污染防治與修復。E-mail：375254377@qq.com

史靜E-mail：383110966@qq.com