表達綠色熒光蛋白重組鴨腸炎病毒構建

孫 瑩，李俊平，黃小潔，李 嶺，曹明慧，李啟紅，李慧姣，楊承槐

（中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

表達綠色熒光蛋白重組鴨腸炎病毒構建

孫 瑩，李俊平，黃小潔，李 嶺，曹明慧，李啟紅，李慧姣，楊承槐

（中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

【目的】鴨腸炎病毒（duck enteritis virus，DEV）不同毒株間存在明顯差異，DEV疫苗株的UL2基因在195bp后連續缺失528bp，導致第65位氨基酸后連續缺失176aa［1］。將綠色熒光蛋白（GFP）基因插入DEV UL2基因中，獲得表達綠色熒光蛋白的重組病毒，以研究UL2基因對DEV生物特性的影響和探討DEV作為載體表達外源基因的可行性。【方法】以實驗室保存的DEV細胞適應株DNA為模板，利用PCR技術擴增出病毒UL2基因上下游序列并克隆入pMD-18T載體；以UL2基因作為外源基因插入靶點及同源重組臂，將CMV啟動子控制的含有GFP-gpt基因表達盒克隆入DEV UL2基因中，構建含GFP基因的轉移質粒載體pT-UL2-GFP-gpt；用脂質體將其與DEV細胞適應株共轉染CEF細胞，待80%細胞出現病變后，凍融3次，接種到新鮮CEF細胞單層的6孔培養板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋，在熒光顯微鏡下挑取單個有綠色熒光的蝕斑，再接到新的細胞上，重復蝕斑篩選、純化表達綠色熒光蛋白的重組病毒；利用 PCR、基因測序技術鑒定重組病毒；重組病毒接種CEF（moi=0.01），每12h取出1瓶接毒細胞，分別收集上清和細胞，測量其病毒含量，繪制一步生長曲線；重組病毒在CEF中連續傳代20次，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，并用PCR檢測GFP的傳代穩定性；重組病毒免疫4周齡SPF鴨后14d，肌肉注射接種DEV強毒（CVCC AV1221），觀察免疫保護情況。【結果】經雙酶切鑒定，成功構建了含綠色熒光蛋白報告基因的轉移質粒載體pT-UL2-GFP-gpt，將其與DEV共轉染CEF細胞后 8h，即可見轉染細胞中有帶有綠色熒光的梭形細胞，經過 8輪蝕斑篩選，獲得純化的重組病毒 rDEV-△UL2-GFP-gpt；PCR鑒定及基因測序結果顯示，GFP標記基因成功地插入到DEV基因組中，替換了DEV UL2基因的196—723位核苷酸；一步生長曲線結果顯示，重組病毒在細胞和上清中的病毒含量分別在36h和72h達到峰值，為106.2TCID50/0.1mL、105.5TCID50/0.1mL，與親本毒無明顯差異；重組病毒在CEF中連續傳代，1—5代可以穩定表達GFP基因，第6代起，開始出現少量沒有熒光的細胞病變，15—20代中絕大部分細胞病變無綠色熒光，GFP在細胞連續傳代過程中容易出現突變；重組病毒以103.0TCID50/只免疫麻鴨，免疫后14d能完全抵抗DEV強毒株的攻擊，與親本毒免疫原性一致。【結論】成功構建了表達綠色熒光蛋白的DEV，首次證實UL2基因缺失不影響其在細胞中的復制，也不影響其免疫原性。熒光重組病毒的構建為DEV UL2基因功能、活載體疫苗研究奠定了基礎。

鴨腸炎病毒；UL2基因；綠色熒光蛋白；重組病毒

0　引言

【研究意義】鴨腸炎病毒（duck enteritis virus，DEV），又稱鴨瘟病毒，屬于皰疹病毒科，能引起鴨、鵝等雁形目禽類發生急性、熱性、敗血性的傳染病。該病也稱為鴨瘟，發病率和死亡率很高，對水禽養殖業危害很大［2］。【前人研究進展】1923年荷蘭首次報道了該病。1957年，黃引賢在中國最早報道該病并分離到病毒［3-4］。目前預防鴨瘟的主要措施為疫苗免疫接種。常用的疫苗有雞胚化弱毒活疫苗和滅活疫苗。皰疹病毒基因組很大，可表達外源基因作為活載體疫苗［5］，如表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重組火雞皰疹病毒（HVT）活疫苗，免疫效果良好［6-8］。DEV基因組為158—162 kb［1，9-13］，宿主范圍小，且具有良好的免疫原性，免疫成年鴨后第3天即可產生一定的免疫力，第4天就能抵抗強毒攻擊（內部資料），因此是很有前景的水禽疫苗病毒載體。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是20世紀90年代中期發展起來的一種報告分子，它是一個238氨基酸的蛋白質，在UV或藍光激發下產生綠色熒光，可直接觀察，被廣泛應用于生物學研究［14-15］。【本研究切入點】本研究將GFP插入到DEV UL2基因中，構建出UL2基因缺失的轉移載體，用脂質體轉染的方法將其與DEV共轉染雞胚成纖維細胞（CEF），經8輪蝕斑篩選、純化，獲得了表達GFP的重組DEV，測定了其體外生長特性和免疫原性。【擬解決的關鍵問題】本研究旨在探究UL2基因對DEV生物特性的影響以及 DEV作為載體表達外源基因的可行性，為 DEV UL2基因功能、DEV活載體疫苗研究奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1試驗時間、地點

試驗于2014年6月至2015年7月在中國獸醫藥品監察所完成。

1.2試驗材料

1.2.1毒株和細胞 DEV細胞適應毒由中國獸醫藥品監察所病毒制品檢測室保存；SPF雞胚由北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司提供。按照文獻［16］的方法制備CEF。

1.2.2質粒和菌株 含有 GFP基因的載體pT-GFP-gpt由中國獸醫藥品監察所病毒制品檢測室構建保存；pMD18T載體購自大連TaKaRa公司，DH5α受體菌購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.3主要試劑 Ex Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、T4 DNA 聚合酶購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清、M199培養液購自Hyclone公司；OPTI-MEM培養液購自Gibco公司；lipofectamine2000購自Invitrogen公司；無內毒素高純質粒提取試劑盒 Endo-free plasmid mini kit II購自Omega公司。

1.2.4引物試驗所用 PCR引物見表1，由上海Invitrogen生物公司合成。

表1　目的基因的擴增引物及鑒定引物Table 1 Primers for amplification and identification of target gene

1.3試驗方法

1.3.1基因組DNA的提取 取DEV病毒液437.5μL，加入蛋白酶K（20mg·mL-1）12.5μL、10%SDS 50μL； 56℃水浴1 h；分別用酚、酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1、氯仿各抽提1次；取上清，加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，-20℃放置30 min；12 000×g離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌1次，沉淀溶于30μL去離子水中，-20℃保存備用。

1.3.2重組質粒的構建 重組質粒 pT-UL2-GFP構建策略見圖1。以提取的DEV基因組DNA為模板，分別擴增UL2基因上下游兩端同源臂UL2-u、UL2-d。將兩同源臂片段分別克隆到pMD18T載體，測序正確后，再分別雙酶切下UL2-u、UL2-d后連接，獲得重組質粒pT-UL2ud。將重組質粒pT-UL2ud用SalI酶切，電泳回收去磷酸化后，與用SalI酶切的pT-GFP-gpt連接，將GFP-gpt表達盒插入到pT-UL2ud中，獲得重組質粒pT-UL2-GFP-gpt。

圖1　重組病毒的構建Fig.1 Construction of recombinant DEV

1.3.3重組病毒的制備、純化及鑒定 按說明書進行高純度轉移載體的提取。DEV接種CEF（moi=0.1），吸附1—2 h后，按Lipofectamine 2000說明書轉染高純質粒pT-UL2-GFP-gpt。轉染后72—96 h，觀察細胞病變情況，待80%細胞產生病變后，凍融3次，接種到新鮮CEF細胞單層的6孔培養板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋，置5%CO2、37℃培養箱中培養72—96 h。觀察熒光，挑取單個有綠色熒光的蝕斑，在細胞上重復多次傳代，直至所有的蝕斑都帶綠色熒光，確定為純化的重組病毒。按1.3.1方法蛋白酶K-SDS方法提取重組病毒DNA，用鑒定引物ORFC17F、ORFC17R進行PCR擴增，PCR產物送上海Invitrogen生物公司測序。

1.3.4一步生長曲線 將重組病毒及其親本病毒分別接種25cm2的細胞瓶中（moi=0.01），接種后每隔12 h取出1瓶接毒細胞，分別收集上清和細胞，測量其病毒含量，繪制一步生長曲線。

1.3.5重組病毒的穩定性 將重組病毒接種 CEF （moi=0.01），待80%細胞產生病變后，凍融3次，再接種CEF，如此連續傳代20次。熒光顯微鏡下觀察每代重組病毒的綠色熒光表達情況。按1.3.1方法提取病毒DNA，用引物ORFC17F、ORFC17R進行PCR鑒定外源基因GFP是否穩定存在。

1.3.6免疫原性測定 將15只4周齡SPF鴨，隨機分成 3組，每組 5只。第 1組肌肉注射 rDEVΔ UL2-GFP，每只103TCID50，第2組肌肉注射DEV親本毒，每只103TCID50，第3組不免疫，作對照。每組單獨隔離飼養。在免疫后14 d，腿部肌肉注射接種DEV強毒（CVCC AV1221），每只103MLD。觀察10 d，每天記錄發病死亡情況。

2　結果

2.1重組質粒的構建及鑒定

2.1.1同源臂的擴增 以DEV細胞適應毒基因組為模板，分別用上游引物DEV UL2-uF1、UL2-dF1，下游引物DEV UL2-uR1、UL2-dR1擴增，結果擴增出1.1kb左右片段（圖2-A）和1.3kb左右片段（圖2-B），這與理論值相符。PCR產物克隆到pMD18T載體，轉化 DH5α，分別獲得了重組質粒 pMD18T-UL2u和pMD18T-UL2d。測序結果表明，本試驗擴增的片段序列與已發表序列同源性100%。

圖2　重組質粒的構建及酶切鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmid

2.1.2重組質粒pT-UL2ud的酶切鑒定 用限制性內切酶SalI和HindIII雙酶切鑒定重組質粒pT-UL2ud，得到3.8 kb和1.3 kb大小的兩個片段（圖2-C），符合理論值。

2.1.3重組質粒pT-UL2-GFP-gpt的酶切鑒定 將重組質粒pT-UL2-GFP-gpt用限制性內切酶XhoI和BamH I雙酶切鑒定，得到大小為5.6 kb和1.6 kb的兩個片段（圖2-D），符合預期。說明成功構建了含有GFP基因的缺失UL2的轉移載體。

2.2重組病毒的制備、純化及鑒定

2.2.1重組病毒的篩選 用 Endo-free plasmid mini kit II試劑盒提取高純度轉移載體質粒 pT-UL2-GFP-gpt，濃度為1 037μg·mL-1。將該轉移質粒載體轉染CEF細胞后8 h，即可見轉染細胞中有帶有綠色熒光的梭形細胞，說明質粒在細胞中瞬時表達。待80%細胞出現病變后，凍融3次，接種到新鮮CEF細胞單層的6孔培養板中，用含5%血清、1%雙抗、1%瓊脂的M199培養液覆蓋，觀察熒光，挑取單個有綠色熒光的蝕斑，再接到新的細胞上，經過8代篩選，所有的蝕斑都帶綠色熒光，獲得純化的重組病毒。

圖3　表達綠色熒光的重組DEV病毒Fig.3 Recombinant DEV expressing the green flourescent protein

2.2.2重組病毒的鑒定 用特異性引物 ORFC17F/ ORFC17R進行PCR擴增鑒定，得到大小為2 400 bp的片段（圖4），和理論值相符。將PCR產物送上海Invitrogen生物公司測序，測序結果表明，GFP標記基因成功地插入到DEV基因組中，替換了DEV UL2基因的196—723位核苷酸。

圖4　重組病毒的鑒定Fig.4 Identification of the recombinant DEV

2.3一步生長曲線

繪制重組病毒及其親本毒的一步生長曲線。結果表明，親本毒接種CEF后36h，細胞樣品的病毒含量達到峰值106.3TCID50/0.1mL，72 h上清樣品病毒含量達峰值105.5TCID50/0.1mL。重組病毒細胞和上清的病毒含量分別在 36和72 h達到峰值，為 106.2TCID50/ 0.1mL、105.5TCID50/0.1mL，與親本毒無明顯差異（圖5）。表明UL2的缺失對DEV的復制沒有明顯影響，缺失后培養病毒的滴度幾乎無變化。

2.4重組病毒的傳代穩定性

重組病毒經過傳代 20次，觀察綠色熒光在 1 —5代可以穩定表達，從第6代開始綠色熒光病變細胞開始減少，可觀察到少量沒有熒光的細胞病變，15—20代只有很少量的帶有綠色熒光的細胞病變，絕大部分細胞病變無綠色熒光（圖6）。對重組病毒的GPF基因進行PCR、測序，第5代PCR產物大小約2 200 bp，而第20代PCR產物只有800 bp左右。對第 20代重組病毒PCR產物進行測序，發現第 20代重組病毒從 CMV啟動子的101bp至gpt的前208 bp共缺失1 456 bp，包括了GFP基因整個開放閱讀框、部分啟動子和部分gpt基因。

2.5重組病毒免疫原性

重組病毒rDEVΔUL2-GFP及其親本毒免疫 SPF鴨后14d，均能100%抵抗DEV強毒攻擊（表2），表明UL2基因缺失后不影響DEV的免疫原性。

圖5　重組病毒的一步生長曲線Fig.5 One step growth curve of recombinant DEV in CEF

圖6　重組病毒的傳代穩定性檢測Fig.6 Identification of stability of the recombinant DEV

表2　免疫后的攻毒保護效力Table 2 Protective efficacy against lethal challenge post-inoculation

3　討論

本研究通過同源重組將綠色熒光蛋白 GFP插入鴨瘟病毒UL2基因，篩選并純化了表達綠色熒光蛋白的UL2基因功能缺失的重組鴨瘟病毒，并對其生物學特性進行初步研究。表明該重組病毒的生長特性與親本毒相似，且可以在CEF上穩定傳代5次。

人單純皰疹病毒1型（HSV-1）UL2基因編碼了尿嘧啶 DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UNG），UNG是一種普遍存在的極為保守的DNA修復酶，它能將復制過程中dUTP錯誤插入DNA或是胞嘧啶的脫氨基造成的尿嘧啶殘基切除，保證 DNA修復的正確性和順利進行［17-18］。有研究表明，因為培養細胞本身可以提供UNG，因此UL2對HSV-1在細胞培養中的正常復制是非必需的，而在神經系統組織細胞中UNG活性很低甚至無，因而UL2對病毒在神經元中的復制有重要作用；缺失UL2的HSV-1突變體，小鼠顱內直接接種后，其神經毒力比親本毒低10倍，而外周途徑接種后神經毒力低100 000倍［19］。DEV UL2基因是否具有 HSV-1相似功能，目前尚未見報道，有待進一步研究。DEV強毒株UL2位于114 943 —115 944位核苷酸，全長1 002 bp，共編碼333aa，而DEV弱毒Kp63株的UL2基因在195 bp后連續缺失528 bp導致65位氨基酸后缺失176aa［1］。本研究通過同源重組方法，將GFP基因表達盒替換DEV強毒株UL2基因的528 bp，獲得了表達綠色熒光蛋白的重組DEV，為研究DEV UL2基因功能、DEV活載體疫苗奠定基礎。

構建重組病毒時，常用的報告基因有β-半乳糖苷酶基因、二氫葉酸還原酶基因、氯霉素乙酰轉移酶基因、綠色熒光蛋白（GFP）等，這些報告基因各有優缺點［20］。本研究選取比GFP更適合在動物細胞上表達的EGFP和大腸桿菌的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉移酶（gpt）基因作為雙報告基因，提高了重組病毒篩選的效率。然而，本研究發現，GFP在DEV中不穩定，隨著傳代次數的增多，GFP會發生點突變或缺失。GFP在其他病毒中也出現了類似結果［21-23］，這給重組病毒的反向篩選帶來了不小難度，本研究結果提示，GFP作為重組 DEV的報告基因，應盡量減少傳代次數，控制在5代內。

4　結論

4.1本研究應用同源重組技術，將GFP-gpt表達盒插入到UL2基因，成功構建了一株表達綠色熒光蛋白的重組DEV，并對重組病毒的生物學特性進行了初步研究。

4.2重組病毒的免疫原性和生長特性都與親本毒相似，表明UL2基因的缺失對DEV的復制無明顯影響，首次證明UL2對DEV在細胞中的復制是非必需的，而且UL2缺失后不影響DEV的免疫原性，是一個比較穩定的外源基因插入位點。

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（責任編輯 林鑒非）

Construction and Characterization of Recombinant Duck Enteritis Virus Expressing the Green Fluorescent Protein

SUN Ying，LI Jun-ping，HUANG Xiao-jie，LI Ling，CAO Ming-hui，LI Qi-hong，LI Hui-jiao，YANG Cheng-huai
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081）

【Objective】Compared with duck enteritis virus （DEV） virulent strain，the vaccine strain has a 528 bp-deletions at the UL2，resulting to a 176 aa deletion after amino acids 65. To study the effect of UL2 gene on virus biological properties and explorethe feasibility of the DEV as a carrier to express foreign gene，a recombinant DEV expressing the green fluorescent protein （GFP）were constructed.【Method】In this study，the UL2 gene of DEV was chosen as a target site and homologous arm for recombination. Two fragments of UL2 gene were amplified by polymerase chain reaction （PCR） with DNA of DEV cell-adapted strain as template，and were cloned into the pMD-18T vector. The expression cassette including GFP gene and gpt gene controlled by CMV promoter was cloned into UL2 gene as a transfer vector pT-UL2-GFP-gpt. Confluent CEF monolayers were transfected with DEV and Lipofectamine 2000 was used as the transfer vector. When the cytopathic effect （CPE） was observed，the total supernatant and cells were harvested. The infected virus was diluted and then plated on the fresh CEF，and overlaid with M199-FBS containing 1% agarose. When green fluorescent plaques were observed，plaque-purification was carried out to obtain a green fluorescent plaque population termed rDEV-△UL2-GFP-gpt，PCR and sequencing assay were used to identify the recombinant virus. CEF cells cultured in 25cm2flasks were inoculated with recombinant virus at an MOI of 0.01. The cells and supernatants were harvested respectively every 12 hours，the titer of virus were measured and the one-step growth analyses was performed； To evaluate the genetic stability of GFP gene in the recombinant virus，the virus was passaged in primary CEF 20 times. Four-week-old specificpathogen-free （SPF） ducks were inoculated intramuscularly with the recombinant virus，and the ducks were challenged with lethal DEV （CVCC AV1221） by intramuscular injection at 14 days post vaccination，then the ducks were observed for symptom of disease and death.【Result】The recombinant expression vector pT-UL2-GFP-gpt was correctly constructed，identified by double-enzyme digestion. After 8 hours of transfection，spindle cells with green fluorescent were appeared. After 8 rounds of plaque-purification，the purified rDEV-△UL2-GFP-gpt were obtained. The results of the PCR and sequencing indicated that the GFP expression cassette has already successfully insert into the DEV genome，which replaced 196-723 nucleotide of UL2. The recombinant virus possessed growth kinetics were similar to that of the parental virus，the cell titer peaked at 36 hours with the peak titer 106.2TCID50/0.1mL，and the supernatant titer peaked at 72 hours with the peak titer 105.5TCID50/0.1mL. The virus were passaged in CEF cells 20 times，the GFP gene was stably maintained in 1st to 5th passages，however，from the 6th passage，there was little CPE without green fluorescent，and in 15th to 20th passages，most CPE had no green fluorescent，GFP mutated during subculture. All immunized animals were protected against subsequent challenge with lethal DEV，the insertion of the GFP gene did not alter the protective efficacy of parental virus. 【Conclusion】In this research，the recombinant DEV expressing the green fluorescent protein were successfully constructed，and firstly has confirmed that the deletion of UL2 gene has no effect on virus replication in cells and the immunogenicity in ducks. This study laid a foundation for the research of the function of the DEV UL2 gene and the DEV vector vaccine.

duck enteritis virus； UL2 gene ； GFP； recombinant virus

2016-02-19；接受日期：2016-03-28

北京市自然科學基金（6162025）

聯系方式：孫瑩，Tel: 010-62103640，E-mail：sunyinggoodluck@163.com。通信作者李慧姣，Tel：010-62103518；E-mail：lihuijiao@ivdc.org.cn。通信作者楊承槐，Tel：010-62103640；E-mail：ychenghuai@163.com