具有反秀麗隱桿線蟲捕食能力的根際細菌的篩選及其反捕食機理的研究

何清羚, 劉星星, 蔣秋悅, 周晨昊, 盛　春, 肖　明

(上海師范大學 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234)

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具有反秀麗隱桿線蟲捕食能力的根際細菌的篩選及其反捕食機理的研究

何清羚, 劉星星, 蔣秋悅, 周晨昊, 盛春, 肖明

(上海師范大學 植物種質資源開發協同創新中心,上海 200234)

雖然生物菌肥具有多效、環保、可持續等多種優點,但經常被生活在土壤中的其他生物捕食而減少其實際應用效果.細菌為應對捕食演化出多種機制,排斥或殺死線蟲.對具有反捕食能力的菌株進行篩選,能夠得到具有高競爭力的菌株.以秀麗線蟲為樣本,對細菌進行對峙試驗,得到兩株具有較高反捕食能力的植物促生細菌:橘黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)JD37、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)P13.以大腸桿菌(Escherichia coli)OP50為對照,線蟲對3株細菌的偏好性由強至弱依次為P13、OP50、JD37.緩慢殺線試驗中,JD37、P13對秀麗線蟲的致死率分別達26.12%和18.66%.在單培養下,JD37能使線蟲活力下降,產卵數量減少.化學和分子生物學研究顯示:JD37不能產生任何已知的殺線次級代謝產物,而P13能夠產生氰化氫(HCN).以上結果表明JD37能夠抵御秀麗線蟲捕食,在捕食壓力下有較強競爭力,作為生物菌肥具有廣泛的應用前景.

生物菌肥; 假單胞菌; 秀麗隱桿線蟲; 次級代謝產物

0　引　言

隨著生物農業的產生和發展,越來越多的植物促生菌被鑒定和廣泛應用.然而其實際運用卻遭遇諸多瓶頸,表現之一是,盆栽試驗中效果卓越的菌株運用到大田試驗中的結果常常不盡如人意.人們對菌劑效果削弱的原因也有諸多見解[1],具體而言,土壤原生環境種的動物、植物、土著微生物以及變化多端的環境因素都會對菌劑效果產生影響.

線蟲在土壤中數量眾多,是最為常見的土壤動物之一.土壤線蟲與根際細菌共享同一生境,常常取食細菌或植物為生[2].據報道,線蟲捕食是細菌死亡的主要原因[3],抵御線蟲捕食對細菌的生存至關重要.秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種典型的細菌捕食者,在線蟲和許多其他領域的研究中被用作模式生物.秀麗隱桿線蟲在20 ℃的實驗室中,平均壽命約為2～3周,而發育時間只須幾天,是一種理想的試驗動物.對秀麗線蟲的研究也能夠反映細菌對植物寄生線蟲等其他線蟲或其他土壤自由生生物的作用.

橘黃假單胞菌JD37是一株植物促生細菌(PGPR),同時具有生防作用[4].已測試了該菌株盆栽和田間實驗中對蔬菜的防病促生效果,田間試驗中的效果與盆栽試驗相比有所減弱,但減弱量并不顯著,引起了人們的關注.熒光假單胞菌P13是另一株具有生防作用的菌株,已證實能防治多種植物病源體[5].假單胞菌往往能夠產生多種復雜的次級代謝產物,許多具有植物促生或生物學防治效果,其中也包括對線蟲的控制.最主要的兩種次級代謝產物為氰化氫(HCN)和2,4-二乙酰基間苯三酚(2,4-DAPG),已被證實對線蟲具有排斥和毒殺作用[6].

本研究著重觀察了秀麗線蟲與上述兩株細菌的多種交互關系.采用簡單的實驗室方法來判斷這兩株細菌是否能夠排斥甚至毒殺線蟲,或者直接被線蟲捕食.還觀察了這兩株細菌在線蟲生長培養基(NGM)上與理想食物大腸桿菌OP50對比對線蟲的吸引力.用從番茄根際土壤中分離的菌株作對照組,通過化學和分子生物學方法確定了兩株細菌產生已知殺線物質的能力.

1　材料和方法

1.1生物材料

野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)N2,尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli)OP50,由華中科技大學吳政星教授提供.橘黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)JD37,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)P13,沙雷氏菌(Serratia)XTC-15均為實驗室現有菌株.JD37和P13均為生防菌株,JD37同時也是植物促生菌.C-15為苯酚耐受菌株,可能產靈菌紅素.

TRN1～14從番茄根際用營養肉湯培養基(NB)分離得到.土樣一取自金山廊下果蔬園B35號棚,采樣時間為2014年2月28日,2013年8月種植番茄.土樣二取自河南省新鄉市延津縣,采樣時間為2014年6月,取自受根線蟲侵染的番茄根際.從土樣一中篩得TRN1～9,從土樣二中篩得TRN10～14.

線蟲培養使用NGM培養基(2.5g蛋白胨,3gNaCl,20g瓊脂,975mL去離子水,1mL1mol/LMgSO4,1mL1mol/LCaCl2,25mL1mol/LKPO4緩沖液,1mL5g/L(5mg/mL)膽固醇),培養溫度為14 ℃.大腸桿菌OP50用蛋白胨肉湯培養基(LB)在37 ℃溫度下培養.JD37和P13用金氏培養基(KMB)在28 ℃溫度下培養.TRN菌株用NB培養基培養,溫度同樣為28 ℃.

1.2緩慢殺線試驗

根據Nina等[6]的方法,用緩慢殺線試驗評價JD37等菌株對秀麗線蟲的致死性效應.通過與多株根際細菌相比較,篩選出具有較高線蟲毒性的菌株,評價實驗室現有生防菌株的反捕食水平.實驗周期為24h.由于秀麗線蟲自孵化至性成熟需要2～3d,該實驗周期能夠保證在線蟲充分接觸菌株的同時,不會大量繁殖影響對死亡率的判斷.待測菌株過夜培養,用M9緩沖液(5gNaCl,3gKH2PO4,6gNa2HPO4,1mL1mol/LMgSO4,加H2O至1L)洗下,稀釋懸液至OD600 =0.5,每孔15μL接種到添加1%TSB培養基(15g/L瓊脂,300mg/L胰蛋白酶大豆肉湯)的24孔板上,適宜溫度下培養2h(每組6個重復).混合蟲齡的線蟲用M9緩沖液洗下,每孔添加10μL約60條線蟲.在試驗開始和24h后分別計數存活及死亡的線蟲數.沒有可見行動的線蟲判斷為死亡.

1.3雙向偏好性試驗

為了評價線蟲對OP50、JD37和P13的偏好性,采用Emad等[7]的方法進行雙向偏好性試驗.試驗采用直徑為90mm的NGM平板.試驗菌株接種在平板兩側,距離中軸約1.5cm的位置,孔直徑約為0.5cm.隨后將線蟲接種在平板中央,使其能夠自由選擇向NGM平板兩側的菌落移動.每種處理重復3次.20 ℃下培養24h后,計數兩側菌落上的線蟲數,每一株中線蟲對兩株對照株的偏好性的總數計數為統計數據.選擇性系數(CI)計算方法如下:

如果CI=-1.0則線蟲完全偏好被測菌株2;CI=+1.0則線蟲完全偏好被測菌株1;CI=0則線蟲無偏好.

試驗共設置5個處理組,分別為:兩側接種JD37,兩側接種P13,兩側分別接種JD37和OP50,兩側分別接種P13和OP50,以及兩側分別接種JD37和P13.

每組3個重復,試驗共進行4次.

1.4毒性試驗

毒性試驗用以觀測JD37和P13對線蟲的長期影響[8].實驗周期為7d,當線蟲出現行動遲緩、死亡或繁殖力下降等現象,均表明菌株影響線蟲健康,即菌株對秀麗線蟲具有長期毒性.JD37和P13在NGM培養基上過夜培養,隨后接種混合蟲齡的秀麗線蟲,接種數量約100條.接種線蟲的平板在16 ℃下培養1周后接受鏡檢.觀察線蟲繁殖情況,計數線蟲每10秒曲體次數(頭部或尾部完成一個半波軌跡計為一次曲體).接種線蟲和大腸桿菌OP50的NGM平板作為對照組.每塊平板計數10條線蟲,每組3個重復,總數為每次每菌株計數30條線蟲.

1.5產生次級代謝產物能力的鑒定

分別用化學和分子生物學手段鑒定JD37、P13和C-15產生HCN的能力及JD37和P13產2,4-DAPG的能力.

用苦味酸試紙試驗鑒定產HCN能力[9].取待測菌株劃線接種于添加4.4g/L甘氨酸的NB培養基.將苦味酸試紙用2%Na2CO3溶液濕潤貼于培養皿蓋上,已接菌的培養皿倒扣,封口膜密封.28 ℃下培養4d.濾紙顏色由黃色轉為紅色說明有HCN產生.

phlD基因是菌株合成2,4-DAPG過程中的關鍵基因.對phlD基因片段進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,可初步判斷菌株是否有產生2,4-DAPG的能力[10].采用常規方法提取菌株總DNA,用去離子水溶解.瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量.從生工生物工程(上海)股份有限公司訂購引物,序列如下[11]:

引物1:5′-gacataggatcctccagctttgctgttattgcc-3′

引物2:5′-acagtcaagcttggtgctggtgttttatccgg-3′

PCR反應條件:94 ℃、5min,1 個循環;94 ℃、30s,53 ℃、30s,72 ℃、2min,30個循環;72 ℃、5min,1個循環.

1.6數據分析

使用SPSS18.0和Origin7.5軟件進行數據分析.誤差棒顯示標準誤差.所有重復試驗結果相近.

2　結　果

2.1緩慢殺線試驗結果

圖1為不同菌株對應秀麗線蟲在緩慢殺線試驗中的死亡率,死亡率最高的為JD37組,達到26.12%.其后從高到低依次為:C-15組,24.89%;TRN8組,21.64%;P13組,18.66%;TRN6組,15.28%;TRN14組,14.27%;TRN12組,13.80%.其余組的死亡率與OP50組(0)沒有顯著差異(P<0.01).可見JD37和P13菌株對線蟲的致死能力在根際細菌中處于較高水平,可能具有較好的反捕食能力.由于其他菌株沒有已知的防病、促生效果,因此用JD37和P13兩株細菌作進一步實驗.

2.2雙向偏好性試驗結果

圖2為JD37、P13、OP50 3種細菌相互對比的選擇性系數,數值為4次試驗的平均值.從圖2中可以看出,隨機選擇幾乎不影響試驗結果.JD37相對OP50的CI平均值為-0.59,P13相對OP50的CI均值在0.47.與OP50相比,秀麗隱桿線蟲厭惡JD37,同時對P13表現出偏好,其中JD37的排斥現象更明顯.而當同時存在JD37和P13菌株,JD37相對P13的CI為-0.28,即線蟲同樣偏好捕食P13.可以發現,當存在理想食物,秀麗線蟲很少選擇捕食JD37,但會選擇捕食P13.

在試驗中觀察發現,兩側接種JD37的處理組也出現了明顯的線蟲死亡現象,試驗結束時線蟲數量均較其他組少.同時,在接種JD37和P13的處理組中,線蟲更趨向于不選擇任何一種菌株,即停留在接種區域,表現為CI絕對值較小.這表明P13與JD37共同作用時,可能對線蟲產生更大的毒性.

圖1　線蟲在緩慢殺線試驗中的死亡率,多重字母標記法表示顯著性差異(P<0.01)

圖2　秀麗線蟲在JD37、P13、OP503種細菌相互對比的選擇性系數

2.3毒性試驗結果

圖3為秀麗線蟲喂食3種菌株7d后的每10秒曲體次數.結果顯示:與JD37共培養的線蟲繁殖力顯著下降,平板上幾乎沒有蟲卵出現;P13組平板上線蟲則基本正常繁殖,能夠觀察到許多蟲卵.JD37組線蟲大量死亡,存活線蟲多為成蟲或dauer抗逆幼蟲.P13組線蟲數量沒有下降.各組存活線蟲的每10秒曲體次數分別為5.20(OP50),4.20(P13)和1.60(JD37).與OP50組相比,JD37組秀麗線蟲每10秒曲體次數在7d培養后減半.P13組的效果則沒有JD37組顯著.

圖3　秀麗線蟲喂食3種菌株7 d后的每10秒曲體次數,多重字母標記法表示顯著性差異(P<0.01)

從顯微鏡照片也可看出,與JD37共培養的線蟲較OP50喂養的線蟲更為瘦弱(圖4).

圖4　緩慢殺線試驗放置2 d后光學顯微鏡下秀麗線蟲的照片.(a) OP50;(b) JD37

2.4產生次級代謝產物能力的鑒定

圖5　緩慢殺線試驗放置2 d后苦味酸試制試驗結果.(a) P13;(b) 未變色的苦味酸試紙;(c) C-15;(d) JD37

苦味酸試紙測試結果在圖5中展示.橘黃假單胞菌JD37和沙雷氏菌C-15均不產生HCN,而熒光假單胞菌P13產HCN.這一結果與之前用其他方法得出的結果相同[5].

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物,顯示JD37和P13均沒有phlD基因,即不具有產2,4-DAPG的能力.

3　討　論

捕食細菌的秀麗隱桿線蟲在土壤中營自由生,與根際微生物間有著復雜而多樣的交互關系,已有不少人對之展開了各方面的調查研究.現有研究往往考察的是秀麗線蟲在生態中的作用,而很少將線蟲用于細菌反捕食能力的評價.本課題從這一角度對幾株細菌進行了評價,取得了一定結果.

將從番茄根際土壤中分離得到十余株細菌,通過緩慢殺線試驗篩選證實,與多數根際細菌相比,實驗室現有的具生防、促生能力兩株假單胞菌JD37和P13具有較好的反捕食能力.

在現有的研究中,有兩種關系已得到廣泛證實:捕食與反捕食關系,以及線蟲對細菌的攜帶擴散作用[12-14].在此基礎上,本課題對線蟲與不同菌種間的這兩種作用進行了觀察和研究.

JD37和P13在選擇性試驗中表現出相反的結果:P13吸引線蟲,而JD37則對線蟲產生了更明顯的排斥效應.這一結果顯示,即使同屬生防細菌,不同菌株與秀麗線蟲的共生策略也有所區別:JD37通過各種機制驅使線蟲遠離菌苔以抵御捕食,而P13則可能更傾向于利用線蟲為其傳播帶來便利.同時發現,JD37的活性會影響排斥效應的強度.JD37分泌橘黃色素,色素深淺反應菌株活力.在試驗中發現,當JD37菌落顏色較淺,即菌株活性較弱時,選擇另一側OP50組的線蟲有所減少.這一結果說明JD37的排斥效應很可能是通過次級代謝產物產生的.

與之前對其他假單胞菌菌株的報道相比[6],JD37和P13表現出較弱毒性.考慮到秀麗線蟲在土壤環境中的積極作用,試驗菌株的毒性強度對PGPR而言已值得滿意.毒性試驗中還觀察到,JD37不僅影響秀麗線蟲的健康情況,同時還減少了其產卵量;P13組則沒有這一現象.

次級代謝產物是細菌用以抵御捕食者的最常見手段之一,同時也起到幫助菌株吸引傳播者的作用[6,13].毒性物質對線蟲具有致死效應,因而線蟲會對其敬而遠之.現已知假單胞菌的代謝產物中對線蟲具毒殺或排斥效應的有HCN,2,4-DAPG,PLT,AprA等[6].與預期相反,線蟲毒性較低的P13菌株具有產HCN的能力,而JD37則沒有.在高濃度時對線蟲具有致死作用的2,4-DAPG也沒能在JD37的次級代謝產物中被發現.

本實驗室已對JD37全基因組進行測序[15].通過序列比對發現,該菌株不產生任何一種上述已知的殺線物質.但值得注意的是,JD37在緩慢殺線試驗中的致死率與先前報道的另一株細菌CHA19相比明顯更高[6];而CHA19也不能產生上述任何一種殺線物質,因此被認為是無毒菌株.這一現象表明有未知的殺線毒性物質在JD37與秀麗線蟲的關系中產生了作用,且其重要性比先前認為的更強.

4　結　論

植物促生菌橘黃假單胞菌JD37對野生型秀麗隱桿線蟲N2表現出較為緩和的致死毒性,與大部分根際細菌相比毒性顯著較高.與尿嘧啶缺陷性大腸桿菌OP50相比,秀麗線蟲明顯厭惡JD37菌落;同樣條件下,線蟲傾向于選擇P13菌落.分子生物學研究發現,JD37排斥并毒殺線蟲的機理與已知菌株的主要機理有所不同.JD37對秀麗線蟲的毒性和致死性與熒光假單胞菌P13相比較高,P13據鑒定能夠產生已知的高效殺線的次級代謝產物HCN.本研究觀察到的現象中的機理值得進一步研究.這些結果也為JD37在大田實驗中的進一步應用起到了鋪墊和支持作用.

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(責任編輯：顧浩然)

Study on screening of anti-predator rhizosphere bacterium againstCaenorhabditis elegans and its anti predation mechanism

HE Qingling, LIU Xingxing, JIANG Qiuyue, ZHOU Chenghao, SHENG Chun, XIAO Ming

(DevelopmentCenterofPlantGermplasmResources,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China)

Althoughmicrobialfertilizerismulti-effect,environmentalfriendlyandlong-termefficient,itspracticalapplicationeffectisbutdecreasedforbeingpreybytheothercreatorslivinginsoilfrequently.Manybacteriumhavedevelopedtheirmechanismsthatexpelorkillwormstodefendthemselvesfrompredators.Screeningofanti-predatorrhizospherebacteriumhelpsustofindoutcompetitiveplantgrowthpromotingrhizobacteria(PGPR).UsingCaenorhabditis elegansassample,thisstudyroughlyobservedtwostrainsofbiocontrol:Pseudomonas aurantiacaJD37andPseudomonas fluorescensP13.UsingEscherichia coliOP50ascontrolgroup,wefindthepreferenceorderofworms,fromhighesttolowest,isP13,OP50andJD37.Inslowkillingassay,thedeathrateofwormsforJD37andP13are26.12%and18.66%respectively.TheactivityandreproductionrateofC.elegansdecreasewhenitisfedonJD37.Theresultsofchemicalandmicro-biologicalstudyshowthatJD37cannotproduceanycurrentlystudiedsecondmetaboliteswhichkillworms,whileP13canproduceHydrogencyanide(HCN).AlltheseresultsshowthatJD37hastheabilityofanti-predator,andismorecompetitiveunderpredationpressure,whichsuggestsitsbroadapplicationprospectasmicrobialfertilizer.

microbialfertilizer; Pseudomonas; Caenorhabditis elegans;secondmetabolite

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2016.04.012

2015-03-17

上海市科學技術委員會科研計劃項目(11440502300);上海師范大學一般科研項目(SK201111)

何清羚,中國上海市徐匯區桂林路100號,上海師范大學植物種質資源開發協同創新中心,郵編:200234,E-mail:rosa.skuld.ka@gmail.com;肖明,中國上海市徐匯區桂林路100號,上海師范大學植物種質資源開發協同創新中心,郵編:200234,E-mail:xiaom88@shnu.edu.cn

Q939.96

A

1000-5137(2016)04-0464-07