胰島素依賴型糖尿病大鼠Chock血管擴增的觀察研究

魏鵬，陳薇薇，王建紅，胡斯旺，吳東方，唐茂林，丁茂超，梅勁，章偉文

胰島素依賴型糖尿病大鼠Chock血管擴增的觀察研究

魏鵬，陳薇薇，王建紅，胡斯旺，吳東方，唐茂林，丁茂超，梅勁，章偉文

目的通過新型大鼠皮膚血管實時觀察窗套件（皮窗）直視下觀察糖尿病大鼠和正常大鼠背部穿支體區間Choke血管密度變化情況，以探討糖尿病對大鼠皮瓣Choke血管擴增產生的影響。方法40只成年SD大鼠隨機分兩組，對照組20只（正常大鼠），實驗組20只[腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病模型]。兩組大鼠均選擇左、右髂腰動脈穿支體區間的微血管吻合（即Choke血管）區為目標觀察區制作皮瓣模型，分時間點進行灌注、攝X線片，在Scion Image Beta 4.02中測量各時間點穿支體區間Choke血管的灰度值和穿支體區血管的灰度值，并計算它們的比值（谷-峰比），通過對比總結糖尿病對體區間Choke血管變化規律的影響。結果兩組Choke區皮窗內血管數目、血管直徑、血流速度、血管擴增率及灰度值的谷-峰比差異均有統計學意義（均。結論大鼠背部Choke體區及Choke體區間血管血管擴增成一定時程差異，糖尿病大鼠亦有此規律，但患糖尿病的大鼠Choke血管生長受到很大影響。

糖尿??；皮瓣；大鼠；Choke血管；血管擴增

1987年Taylor等[1]首先提出了“血管體”概念，并將全身體表劃分為40多個“血管體區”。Cormack 等[2]通過分析相鄰血管體之間的關系，將皮膚的血管供區依次分為3個層次：解剖學供區、血流動力學供區及潛在供區。在不同供區之間均有豐富的吻合血管（稱為Chokevessels[1-3]）。唐茂林等[4]解剖學研究顯示，Choke vessels是血管體區之間的連接系統，經此一條源動脈可以跨過其直接的邊界去營養鄰近的皮膚區域。

對糖尿病患者而言，其潰瘍形成的基本病理機制“三因素”中，周圍血管病變是始動因素，動脈閉塞性病變是造成糖尿病潰瘍的重要原因[5]。糖尿病對Chokevessels擴增是否產生影響或產生怎樣的影響仍沒有具體的相關報道。本研究擬以大鼠為研究對象，選擇其左、右髂腰動脈穿支體及其之間的吻合血管（Choke血管）為目標觀察區，結合“皮窗直視血流示蹤模型”觀測胰島素依賴型糖尿病大鼠Choke血管區的正常開放血管與潛在開放血管進行比較，探討糖尿病對大鼠皮瓣Choke血管擴增產生的影響。報道如下。

1　資料與方法

1.1動物及分組本實驗所有的步驟嚴格遵循現行動物實驗法的規則。取40只300 g左右的成年SD雄性大鼠，溫州醫科大學實驗動物中心提供。室溫控制在24℃，大鼠經過12 h光照，喂養標準大鼠飼料和水1周。然后隨機分為對照組和實驗組，各20只。實驗組建立胰島素依賴型糖尿病模型。

1.2胰島素依賴型糖尿病模型測量實驗組大鼠的初始體質量和基本血糖水平，然后按照相應體質量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）來造模。70 mg/kg的STZ溶于0.1molpH值為4.5的檸檬酸鈉溶液中，30 min內腹腔注射入大鼠體內。同時，對照組大鼠行無STZ檸檬酸鈉溶液腹腔注射。注射72 h后，通過尾靜脈測量大鼠的血糖水平。每周用快速血糖儀（瑞迪恩）通過大鼠的尾靜脈血測量血糖水平。測量血糖之前禁食8 h，不禁水。

鼠族血糖正常水平為50～135mg/100ml[6]。本研究中，大鼠的空腹血糖水平＞16.8mmol/L認定為糖尿病。注射11周后通過測量血糖確定了實驗組大鼠的高血糖狀態后，并再次稱體質量。

1.3安裝新型大鼠皮膚血管實時觀察窗套件（皮窗）[7-8]，體視顯微鏡觀察-指標記錄計算取兩組大鼠各10只，均腹腔注射戊巴比妥進行麻醉，劑量為40～50 mg/kg。伸展大鼠四肢固定在平板上，背部手術區域先剪去毛，然后用脫毛膏去干凈毛根。背部去毛后，根據大鼠背部主要穿支動脈分布特點，選取左髂腰動脈穿支體之間的Choke血管作為觀察對象并設計皮瓣模型，依據實驗需要，設計皮窗（窗口為圓形，直徑1 cm，材料為塑料）。安裝時不切取皮瓣及離斷穿支以免影響正常血流，手術時皮窗觀察窗要對準Choke區(封二彩圖4)。用直徑1.5 mm微型螺釘、4個0縫線進行縫合固定，然后單籠飼養，給大鼠飼料和水。所有手術操作都由同一個術者完成。

術后1 h，仍在麻醉狀態下，應用尾外側靜脈注射1 m1 2%的伊文思藍(Evans blue，Sigma公司)方法，體視顯微鏡（Leica-DFC320，萊卡公司）10倍目鏡下活體直視觀察(每次觀測時，采用相同放大倍數)。用數碼相機攝片記錄Choke血管區的數目、直徑、曲度、血流速度及血管擴增率等指標。在兩只通過尾外側靜脈注射伊文思藍的大鼠身上，通過皮窗，Choke區完整的動靜脈循環都能通過視頻完整的記錄下來。通過測量某一段動脈的長度及從視頻讀出伊文思藍流過這段動脈的時間，便能算出任一節段內動脈的血流速度。封二彩圖5為伊文思藍第1次經過皮窗內血管網的4張截圖。在顯微鏡活體直視皮窗中測量紅色箭頭標志的血管的長度，從視頻可以讀出伊文思藍從這段動脈的起點到端點共花費的時間，從而可以算出這段動脈內的血流速度。再分4個視野拍照后重新合成，統一視野大小和像素，導入Scion Image Beta 4.02內，每個象限內任意挑選2個較為固定的血管測量點（Choke動脈），術后1h測量Choke血管相對直徑（以像素表示）。

1.4谷-峰比計算另取兩組大鼠各10只，麻醉后開胸、腹腔，經左心室插灌胃針，37℃0.9%氯化鈉注射液灌洗體循環后，以20%明膠（Sigma BY12100，Boyun Biotech）-氧化鉛（國藥集團上海化學試劑有限公司）混懸液（容重比為1∶1），按100 ml/kg體質量的劑量行體循環動脈灌注，再將大鼠置于－20℃的冰柜中，2 h后取下大鼠整塊皮膚，攝X線片（攝片參數：球管高度105cm，電壓75kV，曝光時間250ms，曝光方式100mA大焦）。將所得X線片導入Scion Image Beta 4.02內，截選左、右髂腰動脈穿支體及之間的區域，繪制灰度值的地圖及其線性漸變圖，讀取兩穿支體區灰度值（以峰值主體部分讀數），即為VP1、VP2，以及穿支體區之間微血管吻合區的灰度值VV，計算“VV/[（VP1+VP2）/2]”，即為灰度值的“谷-峰比”（封三彩圖1）

1.5統計方法數據采用SPSS16.0軟件處理，計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗。為差異有統計學意義。

2　結果

兩組Choke區皮窗內血管數目、血管直徑、血流速度、血管擴增率及灰度值的谷-峰比差異均有統計學意義（均見表1。

3　討論

3.1Choke血管研究中應用的2個重要參數[7-8]

3.1.1谷-峰比本文谷-峰比實驗中的對象為活體SD大鼠，經左心室作主動脈插管、以37℃0.9%氯化鈉注射液充分灌洗體循環后，明膠-氧化鉛混懸液填充動脈并能進級的微血管，氧化鉛顆粒對微血管充填效果良好，攝X線片不但能顯示較粗動脈，還能顯示大體視野中肉眼不能見的微血管，未見微血管顯影不連續。因此，基于X線灰度值計算得出的谷-峰比，更能體現“穿支體區間的微血管總量”和“穿支體區血管總量”的比率，其變化曲線反映了穿支體區間微血管總密度的變化情況。

3.1.2擴增率實驗過程中，在體視顯微鏡下選定為固定測量點的血管，在觀察視野中多相對較粗的choke血管，計算所得的擴增率呈時相性變化，可以體現相對較粗choke血管的擴增規律（其形成第二個擴增高峰的原因也還有待研究）。但細微的choke血管信息卻未被涵蓋在其中，該指標也就不能反映細微choke血管的變化規律。

3.2糖尿病對Choke血管影響的分析

3.2.1糖尿病對Choke血管血流的影響本實驗結果顯示糖尿病大鼠Choke區皮窗內血管的血流速度相比對照組緩慢。皮瓣存活最重要的因素是皮瓣微循環有足夠的血流量來提供營養，而糖尿病血管病變的始動因素是內皮功能受損導致的血管炎癥反應。糖尿病高血糖、高胰島素以及氧化應激等因素引起內皮細胞結構和功能改變，進而導致血管損害[9]。Loomans等[10]和Tepper等[11]分別通過研究證明糖尿病患者內皮祖細胞（EPCs）的數量下降、功能降低，無論1型還是2型糖尿病，其EPCs的增殖、黏附、整合入血管結構以及成血管能力均顯著下降，表明糖尿病患者血管修復、血管生成能力降低。

同時糖尿病患者，由于組織生長、再生和修復過程中的改變，其蛋白質合成降低的同時代謝增強，成纖維細胞減少，這就導致愈合功能的降低。Rendell 等[12]報道糖尿病大鼠背部和尾部的血流在第4周降低，這與糖血紅蛋白的升高是一致的。糖尿病期間[13]，營養皮膚、肌肉的血循環降低，內皮增生，增加了血小板的黏附性和聚集性，促進血栓素的產生，引起脂蛋白機制的變化。糖尿病導致的高血糖癥導致靜脈回流障礙。所有這些效應引起高凝結狀態[14]，導致皮瓣微循環血流減慢、血流量減少。

3.2.2糖尿病對 Choke血管擴增率和谷-峰值的影響本實驗中，對照組Choke血管擴增率和谷-峰值與胡斯旺等曾報道的結果基本一致，不同時間段左、右髂腰動脈穿支體區間的Choke血管擴增規律為：在第1天即逐漸增粗，至第4～6天達高峰，然后逐漸下降，第10～16天時再次出現增粗[8]。谷-峰比值基本都在第3天達到峰值[7]。實驗組Choke血管擴增率和谷-峰值與對照組比較也呈現一定的時程差異，但是在各個對應時間點上數值明顯減小，而且差異有統計學意義（均。說明糖尿病組大鼠Choke血管受到某種程度的損害及其再生受到一定程度的限制。

表1　兩組Choke區皮窗內觀察指標比較

綜上所述，通過皮窗直視下觀察大鼠背部Choke血管密度變化情況得知大鼠背部 Choke體區及Choke體區間血管血管擴增成一定時程差異，糖尿病大鼠亦有此規律，但是患糖尿病的大鼠Choke血管生長受到很大影響，即糖尿病對Choke血管在某種程度影響了其正常生長。至于糖尿病具體通過何機制影響Choke血管的生長及采取何種方法減小這種影響有待于進一步研究。

[1]Taylor GI,Palmer JH.The vascular territories(Angiosome)of the body:experimental study and clinical applications[J].Br J Plast Surg,1987,40(2):113-141.

[2]Cormack GC,Lamberty BG.The arterial anatomy of skin flaps[J]. Br J Plast Surg,1986,39(3):300-306.

[3]Taylor GI,Minabe T.The angiosomes of the mammals and other vertebrates[J].Plast Reconstr Surg,1992,89(2):181-215.

[4]Tang M,Yin Z,Morris SF.A pilot study on three-dimensional visualization of perforator flaps by using angiography in cadavers[J].Plast Reconstr Surg,2008.122(2):429-437.

[5]管珩,劉志民,李光偉,等.50歲以上糖尿病人群周圍動脈閉塞性疾病相關因素分析[J].中華醫學雜志,2007.87(1):23-27.

[6]Kamal K,Powell RJ,Sumpio BE.The pathobiology of diabetes mellitus:implications for surgeons[J].J Am Coll Surg,1996,183 (3):271-289.

[7]胡斯旺,毛海蛟,莊躍宏,等.再探大鼠背部穿支體區間choke血管變化規律[J].中國臨床解剖學雜志,2014,32(6):690-693.

[8]胡斯旺,莊躍宏,崔懷瑞,等.大鼠背部穿支體區間choke血管變化規律初探[J].中國臨床解剖學雜志,2014,32(5):580-584,589.

[9]Nassar T,Kadery B,Lotan C,et al.Effects of the superoxide dismutase mimetic compound tempol on endothelial dysfunction in streptozotocin induced diabetic rats[J].Eur J Pharmacol,2002, 436（1/2）:111-118.

[10]Loomans C,Koning E,Staal F,et al.Endothelial progenitor cell dysfunction a novel concept in the pathogenesis of vascular complications of type 1 diabetes[J].Diabetes,2004,53(1):195-199.

[11]Tepper OM,Galiano RD,Capla JM,et al.Human endothelial progenitor cells from type 2 diabeties exhibit impaired proliferation, adhesion,and incorporation into vascular structures[J].Circulation,2002,106(22):2781-2788.

[12]Rendell MS,Kelly ST,Finney D,et al.Decreased skin blood flow early in the course of streptozotocin-induced diabetes mellitus in the rat[J].Diabetologia,1993.36(10):907-911.

[13]Kassab JP,Guillot R,Andre J,et al.Renal and microvascular effects of an aldose reductase inhibitor in experimental diabetes.Biochemical,functional and ultrastructural studies[J].Biochem Pharmacol,1994,48(5):1003-1008.

[14]Colwell JA,Nair RM,Halushka PV,et al.Platelet adhesion and aggregation in diabetes mellitus[J].Metabolism,1979,28(4 Suppl 1):394-400.

（本文編輯：鐘美春）

Observation on enlargement of choke vessels among insulin dependent diabetic rats

【Abstract】ObjectiveTo observe the change of density of choke vessels between bilateral iliolumbar perforators in insulin dependent diabetic rats and normalrats to explore the influence to the enlargement ofchoke vessels caused by diabetes mellitus(DM).MethodsForty adult SD rats were divided into two groups randomly;20 normal rats were in the control group,and the others were in the experimental group which were induced by intraperitoneal injection of STZ to be diabetic models.Microvascular anastomoses(choke vessels)were chosen,with the target area designed as the flap model in rats,which was located between the left and right iliac lumbar perforating branches;then gelatinlead oxide angiography was performed.The grey values of choke vessels area(V-valley)and perforasomes(V-peak) were measured in Scion Image Betta 4.02,then the ratio of them was calculated in various time points to summarize the lawofchange ofdensity of choke vessels caused by DM.ResultsThere were significantdifferences in number ofchokevessels,thediameterofchokevessels,the blood velocity,the enlargementratioofchokevesselsandthe ratio of V-valley and V-peak of grey values of choke vessels(all＜0.05).ConclusionsThe enlargement of vessels between choke vessels and the perforasomevessels variesfrom time to time,as well asthe insulin dependentdiabetic rats. However,the growth of choke vessels of DM rats is limited.

Diabetes mellitus;Flap;Rat;Choke vessel;Enlargement of vessel

·病例報告·

·論 著·

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.02.004

R332

A

1671-0800(2016)02-0150-04

2015-11-17

寧波市自然基金資助項目（2013A610264，2015A610207）；寧波大學校級科研項目（xyy15026）

315100寧波，寧波市第六醫院（魏鵬、章偉文）；寧波大學醫學院附屬醫院（陳薇薇、王建紅、胡斯旺）；溫州醫科大學解剖教研室（唐茂林、梅勁、丁茂超、吳東方）

章偉文，Email：673362776@qq.com