miR-146a表達與肝細胞肝癌術后復發的相關性研究

吳其肯，劉玉君，王海江，王利平，梅勇

miR-146a表達與肝細胞肝癌術后復發的相關性研究

吳其肯，劉玉君，王海江，王利平，梅勇

目的研究miR-146a與肝細胞肝癌（HCC）術后復發的相關性以及其潛在分子機制。方法通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測miR-146a基因在HCC術后2年內復發的8例患者以及10例未復發患者癌組織樣本內的表達情況。同時，利用三種交叉驗證實驗分析miR-146a的表達對HCC樣本的術后復發預后的分型準確性。此外，進一步預測miR-146a下游調控基因，然后分析下游調控基因參與的生物學功能以及信號通路，探究miR-146a可能的分子機制。結果miR-146a在術后復發的HCC樣本中表達高于未復發樣本；交叉驗證實驗結果發現miR-146a對HCC樣本有較好的分型準確率分別為73%、75%與72%；最后通過對miR-146a下游調控基因的功能富集分析發現，miR-146a基因參與到細胞增殖、RNA轉錄等HCC術后發展相關的功能與通路中。結論miR-146a具有良好的HCC術后復發預測效能，可做為HCC術后復發的潛在分子標志物。

miR-146a；肝細胞肝癌；術后復發；分子標志物

肝細胞癌（HCC）是對人類威脅最大的惡性腫瘤之一。在世界范圍內，HCC的發病率與死亡率都非常高[1-2]。目前HCC的具體發病機制還遠未闡明，這在很大程度上影響了HCC的早期診斷和治療，同時HCC的術后復發率也是影響HCC生存率的重要因素[3]。因此，在HCC尚未出現復發轉移之前，及早預測、診斷和治療就成為提高HCC生存率的關鍵因素。而在腫瘤診斷領域，miRNA分子是近年來極為受到關注的分子之一，有研究表明miRNAs的表達模式與mRNA的表達模式相比，是更可靠的診斷指標[3]。本研究分別檢測miR-146a在8例HCC術后2年內復發患者和10例未復發患者癌組織樣本內的表達，并進一步分析miR-146a可調控的下游靶基因基因所涉及的生物學功能，希望明確miR-146a與HCC預后的相關，并探索其具體的分子機制。報道如下。

1　資料與方法

1.1HCC組織樣本選取浙江省舟山市婦幼保健院 2010年內手術切除的HCC組織樣本，篩選術后2年內復發的HCC患者組織樣本8例，其中男6例，女2例；年齡58～71歲。篩選術后未復發的HCC患者組織樣本10例，其中男6例，女4例；年齡52～73歲。所有樣本速凍于液氮，－80℃冰箱保存。

1.2miR-146a表達檢測組織總RNA提取常規按照 Trizol試劑說明書的步驟進行，并用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解保存。cDNA合成按照逆轉錄試劑盒說明書進行加尾法逆轉錄，反應結束后將獲得的10 lcDNA置于―80℃保存備用。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗按照miRNA SYBR Green PCR檢測試劑盒說明書操作，反應體系共20 l，反應條件為：95℃15min后，以94℃15s，55℃30s，70℃34s進行40個循環，70℃時采集熒光信號，循環結束后繪制熔解曲線。每個反應均重復3次取平均值。以提取RNA時所加外參Cel-miR-39作為定量參照，用比較Ct值法計算目的基因的相對表達量。

1.3miRNA靶基因預測以及靶基因功能 分 析使 用targetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda 5種軟件進行miR-146a下游靶基因預測，取至少3種軟件同時預測得到的基因為 miR-146a靶基因，共得到40個靶基因。然后使用DAVID數據庫分析靶基因所富集到的基因本體論（GO）功能與生物學通路。設定閾值為錯誤發現率（FDR）＜0.05。

1.4生物信息學分析使用R語言CMA包[4]分別進行留一交叉驗證、十折交叉驗證以及蒙特卡羅交叉驗證計算miR-146a基因表達結果的樣本分型準確性，驗證實驗重復1 000次，得到平均的分型準確率。采用R軟件對結果進行數據分析，組間采用方差分析。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1miR-146a在HCC組織中的表達miR-146a在HCC術后復發樣本表達量8.19±1.22，在術后未復發樣本中相對表達量 5.29±1.98，差異有統計學意義（=3.894，＜0.05）。見封四彩圖8。

2.2miR-146a的分型準確性3種驗證方法的分型準確率分別為73%、75% 和72%。見表1。2.3miR-146a下游調控基因以及相關功能的分析40個miR-146a靶向調控基因大量的富集到“細胞周期”、“細胞死亡”及“凋亡”等相關的生物學功能。同時，發現這些基因也富集到了“Notch信號通路”和“腫瘤通路”等腫瘤相關通路。見表2。

表1　miR-146a的分類效能

表2　miR-146a調控基因的功能富集分析結果

3　討論

肝癌的總體預后很差，因此尋找新的更靈敏特異的肝癌預后標志物具有重要意義。目前研究已發現了大量與HCC發展相關的miRNA，例如miR-139及miR-122等[5-6]。miR-146a定位于基因組5q34，目前研究發現miR-146a在不同的消化系統腫瘤中的表達情況不一致，金麗艷等[7]與崔鵬等[8]分別報道miR-146a在食管癌與胰腺癌中表達顯著上調，而Hou等[9]卻發現miR-146a在胃癌中表達下調。這些結果可能說明miR-146a在不同的腫瘤中所參與的功能與分子機制不一致，其可能具有致癌以及抑癌雙重功能。miR-146a在肝癌中的表達很少見于文獻報道，且具體分子機制也遠未清晰。本研究發現，miR-146a在預后差的HCC組織樣本中明顯的表達增高。證明其與HCC的預后明顯相關，然后通過交叉驗證發現 miR-146a的表達對HCC術后復發的預準確性與穩定性較好，預示該基因可做為HCC預后的潛在分子標志物。此外，通過進一步分析miR-146a下游調控基因參與的生物學功能與通路也側面反映出miR-146a在HCC的術后復發過程中其重要作用。以上結果都顯示miR-146a可做為HCC預后潛在分子標志物，且具有重要的研究價值。

本研究收集的樣本量較少，需要更高樣本量并多中心規模化的驗證。在未來工作中，筆者將進一步篩選其他HCC相關的基因或者其他分子，并與miR-146a聯合組成HCC預后診斷的分子標志物組合，以致力于顯著增加HCC預后預測的普適性以及準確率，為最終將成果轉化向臨床應用做鋪墊。

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[4]Slawski M,Daumer M,Boulesteix AL. CMA:a comprehensive Bioconductor package for supervised classification with high dimensional data[J].BMC Bioin formatics,2008,9(2):439.

[5]Coulouam C,Factor VM,AndersenJB,et a1.Loss ofmiR-122 expression in liver cancer correlates with suppression of the hepatic phenotype and gain of metastatic properties[J].Oncogene,2009,28(40): 3526-3536.

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10.3969/j.issn.1671-0800.2015.02.035

R735.7

A

1671-0800(2015)02-0207-02

2015-03-20

（本文編輯：孫海兒）

316004浙江省舟山，舟山市婦幼保健院

劉玉君，Email:yujunliu 66@163.com