多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥基因分析

朱葵向，金妙玲

多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥基因分析

朱葵向，金妙玲

目的探討多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及其相關的耐藥基因。方法采用肉湯稀釋藥敏板法測定56株銅綠假單胞菌對21種抗菌藥物的敏感性，同時采用聚合酶鏈反應法（PCR）檢測56株銅綠假單胞菌的相關耐藥基因及外膜通道蛋白oprD2基因。結果56株多重耐藥銅綠假單胞菌對頭孢他啶、氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、復方磺胺甲惡唑、復方新諾明、環丙沙星、妥布霉素、替卡西林及頭孢唑林耐藥率為100.0%，頭孢呋辛的耐藥率為94.6%，亞胺培南的耐藥率為89.3%，美羅培南的耐藥率為83.9%；耐藥基因檢測陽性率最高的是膜通道蛋白oprD2基因，陽性率為92.9%。結論多重耐藥銅綠假單胞菌存在耐藥基因，A類與D 類 -內酰胺酶基因的存在使得其對頭孢菌素產生耐藥，對亞胺培南產生耐藥主要與oprD2基因的存在有關。

銅綠假單胞菌；微生物敏感性試驗；多重耐藥；基因

銅綠假單胞菌是一種常見的條件致病菌，屬于非發酵革蘭陰性桿菌，是皮膚軟組織、呼吸道和醫院內等感染最常見的條件致病菌。近年來，由于廣泛過度使用 -內酰胺類抗生素、碳青酶烯酶的產生及廣泛開展各種有創診療操作，使得銅綠假單胞菌的耐藥性不斷上升，其對抗菌藥物的耐藥機制包括多種 -內酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶的產生、外膜通道蛋白D2（OprD2）的缺失、外排泵及靶向突變等[1]。多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的出現，不僅使臨床上的抗感染治療面臨諸多困難和挑戰，而且也容易導致醫院暴發和流行大規模的感染[2]。本研究旨在探討分析臨床上分離出的多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及其相關的耐藥基因，為臨床上進一步合理應用抗菌藥物提供科學依據，報道如下。

1　資料與方法

1.1菌株來源選取2014年6月至2015年6月浙江省浦江縣人民醫院分離并鑒定的銅綠假單胞菌56株，均來自于住院患者的痰液、尿液及傷口分泌物等各類標本。質控菌株購自衛生部臨床檢驗中心，包括：銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）。

1.2藥敏實驗采用肉湯稀釋藥敏板法測定56株銅綠假單胞菌對21種抗菌藥物的敏感性，判斷標準為CLSI2009。21種抗菌藥物均為為英國OXOID公司產品。1.3儀器與試劑采用聚合酶鏈反應法（PCR）檢測56株銅綠假單胞菌的相關耐藥基因及外膜通道蛋白 oprD2基因，PCR儀為AB stepone real-time PCR system，所需要的引物委托上海生工生物技術有限責任有限公司進行合成；所需要的Taq酶、PCR試劑及DNA標志物購買于Fermentas公司。

1.4耐藥基因檢測挑純培養菌落置入0.5 ml離心管內（內已預置200 ng/ml蛋白酶K溶液）。56℃水浴2h，改95℃水浴10 min。15 000 r/min離心30 s，移液器吸取上清液移入另一新的0.5ml離心管作為模板液置入―20℃冰箱備用。采用PCR擴增，按常規方法建立PCR體系，PCR引物序列見文獻[2-3]。PCR擴增產物送上海生工生物技術有限責任有限公司進行DNA雙向序列測定。

2　結果

2.1多重耐藥銅綠假單胞菌對抗菌藥物的藥敏率56株多重耐藥銅綠假單胞菌對頭孢他啶、氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、復方磺胺甲惡唑、復方新諾明、環丙沙星、妥布霉素、替卡西林、頭孢唑林耐藥率為100.0%，頭孢呋辛的耐藥率為94.6%，亞胺培南的耐藥率為89.3%，美羅培南的耐藥率為83.9%，見表1。

表1　56株多重耐藥銅綠假單胞菌對抗菌藥物的藥敏率　株（%）

2.2多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測56株多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測陽性率最高的是膜通道蛋白oprD2基因，陽性率為92.9%，見表2。

表2　56株多重耐藥銅綠假單胞菌耐藥基因檢測陽性率

3　討論

近年來，臨床上廣泛使用廣譜抗菌藥物，使得銅綠假單胞菌耐藥性越來越嚴重，尤其是多重耐藥菌株的出現，給臨床抗感染治療和控制醫院內感染帶來了巨大的困難。所以，對醫院多重耐藥銅綠假單胞菌菌株的耐藥基因情況進行充分的了解，分析其耐藥機制，對臨床用藥的指導及醫院感染的控制具有重大的意義[3-4]。

目前，治療銅綠假單胞菌感染最主要的一類抗菌藥物為 -內酰胺類，隨著臨床上對其大規模使用，銅綠假單胞菌對其耐藥性日益顯現，大多是在抗菌藥物治療過程中獲得或者相應基因表達發生改變而出現繼發耐藥。主要的耐藥機制為產生了 -內酰胺酶和外膜蛋白oprD2表達減弱或缺失。外膜蛋白oprD2是亞胺培南進入菌體特異性通道，如果菌株存在膜通道蛋白oprD2基因，就會抑制 oprD2蛋白的生物活性甚至導致oprD2蛋白缺損，從而對亞胺培南表現耐藥。本研究顯示，膜通道蛋白oprD2基因檢測的陽性率為92.9%，與亞胺培南耐藥率89.3%比較接近，表現為基因型與表型的相對一致，所以oprD2基因的存在是銅綠假單胞菌對亞胺培南抗菌藥物耐藥的主要原因。亞胺培南與美羅培南兩者似乎不存在交叉耐藥，其原因可能與美羅培南不通過oprD2進入細菌胞內有關。但是，由于美羅培南是銅綠假單胞菌主動外排系統 MexAB-OprM的底物，本研究的耐藥率達83.9%，存在繼發耐藥的可能[5-6]。

綜上所述，對多重耐藥銅綠假單胞菌產酶機制和耐藥機制進行深入了解和研究，加強對其耐藥性的常規監測，將有助于制定科學的治療方案，對臨床用藥的指導及醫院感染的控制具有重大的現實意義。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.02.039

R446.5

A

1671-0800(2016)02-0215-02

2015-10-10

（本文編輯：孫海兒）

322200浙江省浦江，浦江縣人民醫院

朱葵向，Email:Zhukx 1971@126.com