HPLC指紋圖譜技術(shù)在景邁茶區(qū)曬青毛茶鑒別中的應(yīng)用研究

馬存強，周斌星，楊超，王洪振，徐正文

1.昆明大樸茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；

3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；4.貴州仙源紅古樹茶業(yè)有限公司，貴州 貴陽550002

HPLC指紋圖譜技術(shù)在景邁茶區(qū)曬青毛茶鑒別中的應(yīng)用研究

馬存強1，2，周斌星2，3*，楊超2，王洪振2，徐正文4

1.昆明大樸茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；

3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；4.貴州仙源紅古樹茶業(yè)有限公司，貴州 貴陽550002

以80個不同年份的景邁、芒景春季曬青毛茶為材料，通過HPLC指紋圖譜技術(shù)分別構(gòu)建了景邁與芒景春季曬青毛茶的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。在景邁春茶標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中有 22個特征峰，芒景春茶標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中有 24個特征峰，有 18個共有峰，其中景邁春茶與芒景春茶僅在表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與表兒茶素沒食子酸酯（ECG）含量上存在一定差異。在景邁春茶、芒景春茶的聚類分析中，由于普洱茶陳化的不確定性和兩地曬青毛茶的相似性，在不同年份曬青毛茶聚類分析中存在一定誤差，在 20個茶樣中有 1個茶樣未被成功聚類。在景邁茶區(qū)與其他茶區(qū)曬青毛茶聚類分析中，能將景邁茶區(qū)春茶（包括景邁春茶與芒景春茶）成功聚類，并與其他茶區(qū)區(qū)別開來。通過相似度分析，景邁、芒景茶樣與標(biāo)準(zhǔn)色譜相似度較高，分別為98.9%和99.2%，其他茶區(qū)春季曬青毛茶與標(biāo)準(zhǔn)色譜相似度較差，在 95%以下。由此可知，HPLC指紋圖譜技術(shù)可用于景邁茶區(qū)相同年份相同季節(jié)曬青毛茶的鑒別，為普洱茶不同茶區(qū)曬青毛茶的鑒別提供了較為科學(xué)的方法。

指紋圖譜；景邁；曬青毛茶；聚類分析

普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種［Camellia sinensis var.assamica（Mast.）Kitamura］曬青毛茶為原料，利用一定工藝制成的具有獨特品質(zhì)特征的茶葉［1］。作為原料，曬青毛茶的質(zhì)量直接關(guān)系到普洱茶成品的品質(zhì)。云南豐富的茶樹種質(zhì)資源、獨特的地理位置、得天獨厚的氣候條件蘊育出不同類型的普洱茶。其中，“山頭茶”由于高品質(zhì)、稀缺性得到社會的認(rèn)可與追捧。然而，“山頭茶”等名貴茶葉主要依據(jù)感官品質(zhì)特征進(jìn)行評定，結(jié)果存在一定誤差且需要經(jīng)驗的積累。因此迫切需要將不同產(chǎn)區(qū)的曬青毛茶量化，并建立客觀公正的鑒別方法。

HPLC指紋圖譜技術(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)色譜圖的建立，結(jié)合聚類分析法（Cluster Analysis，CA），主成分分析法（Principal Analysis，PCA）和相似度分析法（Similarity Analysis，SA）等分析方法已在中草藥鑒別［2-3］、茶葉分類［4-8］中已有了深入的研究。景邁茶區(qū)處于云南省普洱市瀾滄縣景邁山，涉及區(qū)域范圍內(nèi)共包括景邁和芒景兩個行政村。其中景邁村有芒埂、勐本、景邁、糯崗4個村寨；芒景村有翁基、芒景上寨、芒景下寨、芒洪4個村寨。本研究以2011～2014年地理位置相鄰近的景邁、芒景春季曬青毛茶為材料，分別建立景邁、芒景春季曬青毛茶的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，并結(jié)合聚類分析法、主成分分析法和相似度分析法嘗試鑒別不同茶區(qū)、不同年份曬青毛茶。

1　材料與方法

1.1材料

本實驗所用茶樣均由實驗者于當(dāng)?shù)夭杉２铇樱╪=80）茶葉品種為瀾滄拉祜族自治縣惠民鄉(xiāng)景邁芒景茶區(qū) 2011～2014年不同樣品點采集的春茶茶樣（鮮葉要求為一芽二三葉）。其中 2011年景邁春茶 10個茶樣，編號為J1～J10；2012年景邁春茶10個茶樣，編號為J11～J20；2013年景邁春茶10個茶樣，編號為J21～J30；2014年景邁春茶10個茶樣，編號為J31～J40；2011年芒景春茶10個茶樣，編號為M1～M10；2012年芒景春茶10個茶樣，編號為M11～M20；2013年芒景春茶10個茶樣，編號為M21～M30；2014年芒景春茶10個茶樣，編號為M31～M40。所有樣品均由當(dāng)?shù)刂撇鑾煱凑债?dāng)?shù)貢袂嗝柚谱鞴に囍谱魍瓿伞袂嗝柚谱魍瓿珊缶胖糜阡X箔袋中常溫儲存。

另有他人提供的景邁山春季曬青毛茶茶樣若干，用于不同年份景邁茶區(qū)春季曬青毛茶的聚類分析。在茶葉市場購買和在云南其他茶區(qū)收集的曬青毛茶或者普洱茶（生茶）共 10個茶樣，分別為冰島、雙江、勐庫、班章、勐宋、攸樂、老尖山的曬青毛茶和大益、下關(guān)的普洱茶（生茶），用于不同茶區(qū)茶葉的聚類分析。滇紅、福鼎白茶和普洱茶（熟茶）等 12個不同類型茶樣用于相似度分析。

1.2試驗方法

1.2.1HPLC色譜圖

上樣液制備：稱取3 g磨碎試樣于500 mL錐形瓶中，加沸蒸餾水450 mL，立即移入沸水浴，浸提45 min（每隔l0 min搖動1次）。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾并定容至500 mL。茶湯經(jīng)0.45 μm水系膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。

色譜條件［9］為：流動相A為乙腈，流動相B為0.2%乙酸水溶液，色譜柱：安捷倫反相Cl8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為 280 nm；柱溫為 30℃。流速為 1 mL·min-1，梯度洗脫：0～50 min時，A相由8%升至31%，50 min后，A相保持31%，再運行10 min。在此洗脫梯度下，出峰時間均分布，且集中在0～35 min。

經(jīng)考察，保留時間RSD＜3%，峰面積RSD ＜3%；經(jīng)過自動匹配，各指紋圖譜相似度在97%以上。該色譜方法有較好的精密性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可用于指紋圖譜研究。

1.2.2感官審評

參照 GB/T 22111—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品普洱茶》，GB/T 23776—2009，《茶葉感官審評方法》，GB/T 14487—2008《茶葉感官審評術(shù)語》結(jié)合曬青毛茶審評方法對景邁、芒景春季曬青毛茶的色澤、香氣、滋味、葉底進(jìn)行審評，并記錄兩地曬青毛茶的共同點和差異。

1.2.3主要生化成分檢測

水浸出物含量測定，參照 GB/T 8305—2013 茶 水浸出物測定；茶多酚含量測定，參照 GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法；游離氨基酸總量測定采取茚三酮顯色法。

1.3數(shù)據(jù)分析

指紋圖譜數(shù)據(jù)在分析前做了適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，包括背景扣除，譜峰校準(zhǔn)等，利用計算機輔助軟件（中藥色譜相似度評價系統(tǒng)）建立80個樣品的高效液相色譜數(shù)據(jù)的共有模式，以此提取出其特征指紋圖譜。

1.3.1聚類分析方法

聚類分析采用 SAS軟件，以樣品指紋圖譜中色譜峰的峰面積為輸入變量，采用聚類分析方法考察樣本的分類情況，以觀察其他色譜峰對分類結(jié)果的影響，最后繪制樹狀圖，將樣品分類。

1.3.2主成分分析方法

主成分分析法采用SPSS19.0軟件，以樣品中分析選定7個主成分，以其峰面積輸入軟件進(jìn)行分析得到投影圖，用來解釋樣品與樣品，樣品與變量以及變量與變量之間的關(guān)系。主成分分析結(jié)果予以佐證聚類分析法的結(jié)果。

1.3.3相似度分析法

采用SPSS 19.0軟件，將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖中的共有峰峰面積進(jìn)行相關(guān)性分析，得出樣品與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖的相似度。

2　結(jié)果與分析

2.1感官審評結(jié)果分析

從審評結(jié)果（表1）可知，景邁茶與芒景茶均表現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)普洱茶（生茶）的品質(zhì)特征。景邁茶與芒景茶表現(xiàn)出共性，也存在差異性，且共性大于差異性。由于景邁與芒景同屬于景邁山古茶園，地理位置相接近，制茶工藝不存在明顯差異，因而兩地曬青毛茶在外形、色澤等方面不存在差異，滋味的差異性僅表現(xiàn)在芒景曬青毛茶苦澀感明顯，收斂性較景邁茶強的特點。因此，依照傳統(tǒng)感官審評的方法很難鑒別區(qū)分景邁與芒景曬青毛茶的差異。

2.2景邁、芒景茶區(qū)春季曬青毛茶指紋圖譜的繪制

通常建立同類中藥及制劑指紋圖譜主要采用一維指紋圖譜，構(gòu)建共有模式的方法主要是平均值法或中位數(shù)法。本研究采用平均值法繪制標(biāo)準(zhǔn)圖譜。景邁、芒景春季曬青毛茶HPLC指紋圖譜疊加圖如圖1、圖2所示。采用平均數(shù)法構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖3與圖4。

由圖1和圖2可直觀看到，各色譜峰的峰型良好，分離度較好，同時茶樣相對保留時間比較穩(wěn)定，各色譜圖重疊性良好。采用線性和重復(fù)性進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選，在景邁茶區(qū)春季曬青毛茶指紋圖譜中篩選出 22個可以用來定量的峰，在芒景茶區(qū)春季曬青毛茶指紋圖譜中篩選出24個可以用來定量的峰，其他的峰則因為存在較大的誤差而被舍棄。采用多點校正以及平均數(shù)法生成景邁與芒景茶區(qū)春季曬青毛茶的標(biāo)準(zhǔn)圖譜分別為圖3和圖4。

比較相同茶區(qū)的40個樣品的色譜圖，可直觀地看出同一產(chǎn)地的色譜圖相似度較高。通過比較分析景邁、芒景兩茶區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，可直觀看出兩地色譜圖存在一定差異性。主要表現(xiàn)在定量波峰數(shù)量上的差異（景邁標(biāo)準(zhǔn)圖譜中共22個定量峰，芒景標(biāo)準(zhǔn)圖譜中共24個定量峰）和某些定量峰峰面積以及峰高上的差異。

表1　茶葉審評結(jié)果Table 1 The results of tea sensory evaluation

圖1　40個景邁春茶茶樣HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.1 The superposition of HPLC fingerprint diagram for 40 Jingmai spring tea samples

圖2　40個芒景春茶茶樣HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.2 The superposition of HPLC fingerprint diagram for 40 Mangjing spring tea samples

圖3　景邁茶區(qū)春茶標(biāo)準(zhǔn)圖譜（平均數(shù)法）Fig.3 Standard diagram for spring tea from Jingmai tea area（mean value analysis）

圖4　芒景茶區(qū)春茶標(biāo)準(zhǔn)圖譜（平均數(shù)法）Fig.4 Standard diagram for spring tea from Mangjing tea area（mean value analysis）

2.3指紋圖譜分析與評價

根據(jù)80個供試樣品溶液HPLC指紋圖譜給出的參數(shù)，比較供試品圖譜，其中18個峰是80個供試樣品所共有，因此，確定18個峰為80個供試樣品的共有峰，并指認(rèn)了其中10個共有峰（圖 5）。分別為 GA（4號峰），GC（5號峰），可可堿（6號峰），茶葉堿（7號峰），EGC（8號峰），兒茶素（13號峰），咖啡堿（14號峰），EGCG（16號峰），GCG（17號峰），ECG（18號峰）。通過兩茶區(qū)標(biāo)準(zhǔn)色譜圖比對可知，在景邁春茶色譜中16號峰（EGCG）低于 18號峰（ECG）；在芒景春茶色譜中16號峰（EGCG）高于18號峰（ECG）。兩產(chǎn)區(qū)春季曬青毛茶對比可知，兩地春季曬青毛茶僅在EGCG和ECG含量上存在一定差異。EGCG與ECG在苦澀味與收斂性上存在差異。研究認(rèn)為 EGCG苦澀度與收斂性略強于ECG［10-12］。EGCG與ECG含量的差異可能是芒景茶在滋味上較景邁茶苦澀明顯，收斂性強的物質(zhì)基礎(chǔ)。景邁春季曬青毛茶與芒景春季曬青毛茶存在差異的原因來自于兩茶區(qū)不同的海拔高度和茶林的生態(tài)環(huán)境。

圖5　景邁春茶（A）和芒景春茶（B）80個供測樣品HPLC指紋圖譜共有峰Fig.5 Common peaks of HPLC finger-print from 80 test samples of Jingmai spring tea（A）and Mangjing spring tea（B）

2.4聚類分析結(jié)果

基于10個共有峰的峰面積數(shù)據(jù)對80個供試茶樣采用類平均法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果如圖6所示。景邁，芒景春茶雖然屬于同一地區(qū)、茶樹品種相同、加工工藝類似，但由于兩茶區(qū)海拔高度存在明顯差異，通過聚類分析，依舊可以分為景邁春茶和芒景春茶兩類。

2.5主成分分析驗證結(jié)果

通常，檢驗一種化學(xué)計量學(xué)方法的正確性是采用另一種化學(xué)計量學(xué)方法對同樣的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，在這種情況下，最好是采用一種算法完全不同的方法來進(jìn)行驗證［12］。筆者對共有模式的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，取得累積貢獻(xiàn)率大于80%的7個主成分。根據(jù)7個主成分的峰面積大小進(jìn)行主成分分析，得到主成分投影圖（圖7）。從圖7上可以看出80個樣品明顯分為兩類。從另一方面驗證了HPLC指紋圖譜可用于不同茶區(qū)曬青毛茶的鑒定。

2.6HPLC指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用

隨機選取 10份景邁春茶和芒景春茶茶樣，其中包含他人提供的確定來自景邁山茶區(qū)的春季曬青毛茶茶樣。結(jié)果（圖 8）顯示，9個不同年份的景邁春茶茶樣很好地聚在芒景春茶一類里，10個不同年份的芒景春茶很好地聚在芒景春茶一類里，另1個景邁茶樣被單獨聚類。猜測原因主要來自于曬青毛茶陳化的不確定性和景邁春茶與芒景春茶較高的相似度。因此，基于指紋圖譜在不同年份和相鄰茶區(qū)的曬青毛茶中的聚類分析存在一定誤差。

從40個景邁春茶曬青毛茶和40個芒景春季曬青毛茶中隨機分別抽取10個景邁茶樣與10個芒景茶樣，并選取10個其他產(chǎn)區(qū)的春季曬青毛茶或普洱茶（生茶）進(jìn)行聚類分析。聚類分析結(jié)果（圖9）顯示，景邁春茶與芒景春茶能夠被成功聚類，與所選取其他10個不同產(chǎn)地的春季曬青茶樣區(qū)分開來。因此基于HPLC指紋圖譜的共有峰聚類分析法可用于景邁茶區(qū)同一季節(jié)的曬青毛茶鑒定。

圖6　80個樣品聚類圖Fig.6 Dendrogram of 80 tea samples

將測試茶樣圖譜與景邁、芒景春季曬青毛茶標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行相似度分析，結(jié)果如表2所示。不同茶樣與景邁、芒景春季標(biāo)準(zhǔn)色譜圖的相似度分別在80.3%～98.9%，80.3%～99.2%之間。其中景邁、芒景茶區(qū)與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖相似度較高，分別為98.9%與99.2%；滇紅、福鼎白茶、普洱茶（熟茶）因加工工藝與曬青毛茶不同，與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖相似度最低，均在 85%以下；不同茶區(qū)的曬青毛茶以及成品普洱茶（生茶）與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖相似度在91.1%～94.5%之間。通過標(biāo)準(zhǔn)圖譜結(jié)合相似度分析，可對景邁茶區(qū)春茶（包括景邁春茶和芒景春茶）和其他茶區(qū)曬青毛茶進(jìn)行鑒別。

注：△代表景邁春茶，□代表芒景春茶。Note：△ is representative of Jingmai spring tea，□is representative of Mangjing spring tea.圖7 主成分分析圖Fig.7 The results of principal component analysis

3　討論

本研究以不同年份的景邁春季曬青毛茶、芒景春季曬青毛茶為材料，通過HPLC指紋圖譜技術(shù)分別建立了景邁與芒景春季曬青毛茶的標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖。通過景邁與芒景標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對照可知，兩地曬青毛茶相似度較高，僅在EGCG和ECG含量上存在一定差異。而這種差異主要由兩地海拔不同和茶林生態(tài)環(huán)境的不同產(chǎn)生的。HPLC指紋圖譜在不同產(chǎn)地曬青毛茶的鑒別中，可將景邁茶區(qū)曬青毛茶成功聚類，并與其他茶區(qū)的普洱茶區(qū)別開來。通過相似度分析可知，景邁、芒景茶樣與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖相似度較高，分別為98.9%和99.2%，其他茶區(qū)春季曬青毛茶與標(biāo)準(zhǔn)色譜相似度相對偏低，在95%以下，由此可將景邁茶區(qū)曬青毛茶與其他茶區(qū)茶葉區(qū)別開來。因此可知，HPLC可用于景邁茶區(qū)春季曬青毛茶的鑒別。

在普洱茶陳化過程中，由于微生物的參與、陳化環(huán)境的差異，茶葉中的內(nèi)含成分發(fā)生較大變化［13-16］，增加了普洱茶鑒定的難度。景邁與芒景均位于景邁山上，僅在海拔和茶林生態(tài)環(huán)境上存在差異，因而景邁與芒景春茶相似度較高。在不同年份的景邁、芒景春茶聚類分析中出現(xiàn)一定誤差，在20個茶樣中有1個茶樣未被成功聚類。關(guān)于不同年份相鄰產(chǎn)地普洱茶的鑒別有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

通過HPLC指紋圖譜技術(shù)結(jié)合聚類分析、主成分分析、相似度分析可用于鑒別相同年份、不同茶區(qū)的春季曬青毛茶，彌補了感官審評等鑒別方法的不足，為普洱茶不同茶區(qū)曬青毛茶的鑒別提供了較為科學(xué)的方法。

圖8　不同年份的景邁、芒景春茶茶樣聚類分析圖Fig.8 Dendrogram of Jingmai，Mangjing tea samples of different years注：景邁1～景邁5和芒景1～芒景5分別為他人提供的景邁、芒景春季曬青毛茶茶樣。Note：Jing-mai 1-Jing-mai 5 and Mang-jing 1-Mang-jing 5 tea samples were offered by others using Jing-mai and Mang-jing spring sun-dried tea.

表2　茶樣與景邁、芒景春季曬青毛茶標(biāo)準(zhǔn)圖譜的相似性比較Table 2 Similarity analysis of standard diagrams of Jingmai and Mangjing spring tea and tea samples

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Identification of Spring Sun-dried Tea from Jingmai Area by HPLC Fingerprint

MA Cunqiang1，2，ZHOU Binxing2，3*，YANG Chao2，WANG Hongzhen2，XU Zhengwen4

1.Kunming Dapu Tea Industry Co，Kunming 650224，China； 2.LongRun Pu-erh Tea College，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China； 3.College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；4.Guizhou Xianyuanhong Old Tree Tea Industry Co，Guiyang 550002，China

Using 80 spring sun-dried tea samples from Jingmai and Mangjing and different years as materials，standard chromatograms of Jingmai and Mangjing spring tea were constructed by HPLC fingerprint.There were 22 and 24 characteristic peaks in Jingmai and Mangjing standard chromatograms respectively，with 18 shared peaks.Jingmai and Mangjing spring sun-dried tea showed large differences in EGCG and ECG contents.Because of the uncertainty in pu-erh tea storage and the high similarity between Jingmai and Mangjing spring sun-dried tea，there might be some errors in cluster analysis of different years.For example，one of 20 tea samples can not be clustered successfully.Cluster analysis could successfully distinguish spring sun-dried teas from Jingmai area（including Jingmai spring tea and Mangjing spring tea）from other areas.Similarity analysis showed that the similarities between the standard chromatogram and tea samples from Jingmai and Mangjing were 98.9% and 99.2%，which werelower than 95% for tea samples from other areas.In conclusion，HPLC fingerprint was able to identify the sun-dried tea production areas in Jingmai of the same year，which provided a more scientific and complete method for the identification of sun-dried tea from different areas.

HPLC fingerprint，Jing-mai，sun-dried tea，cluster analysis

TS275.2

A

1000-369X（2016）04-379-10

2016-01-13

2016-04-08

紫鵑茶樹調(diào)控花色苷生物合成的MBW轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體研究（C161104）、普洱市古茶園申報世界物質(zhì)文化遺產(chǎn)（kx14040）。

馬存強，男，碩士研究生，主要從事茶葉加工與綜合利用方向的研究。*通訊作者：bxzhou01@126.com