GATA-3啟動子報告基因載體構(gòu)建及其活性鑒定

林豪雨，郭昱顯，林芳芳，孫淑明，盧曉峰，梁偉全，陳春發(fā)

（1.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，2.汕頭大學醫(yī)學院長江學者實驗室　廣東　汕頭　515041）

GATA-3啟動子報告基因載體構(gòu)建及其活性鑒定

林豪雨1，2，郭昱顯2，林芳芳2，孫淑明1，盧曉峰1，梁偉全1，陳春發(fā)1

（1.汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，2.汕頭大學醫(yī)學院長江學者實驗室廣東汕頭515041）

目的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3在人乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要意義.方法從人乳腺癌細胞系MCF-7提取基因組DNA為模板，以PCR方法擴增獲得GATA-3啟動子序列，將片段克隆到pGL3-Basic載體內(nèi)，鑒定后通過報告基因檢測系統(tǒng)檢測GATA-3啟動子報告基因的熒光素酶活性.結(jié)果雙酶切、基因測序鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了GATA-3啟動子報告基因，并在MCF-7細胞內(nèi)鑒定了其具有熒光素酶的表達活性.結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了GATA-3啟動子報告基因載體pGL3-GATA-3pro-Luc，為后續(xù)GATA-3在乳腺癌中表達及其調(diào)控通路以及以GATA-3為靶標的抗腫瘤藥物研究提供了有效工具.

乳腺腫瘤；GATA-3；啟動子；報告基因

GATA-3屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，是乳腺腔上皮細胞的重要標志，在乳腺腔上皮細胞發(fā)生及維持分化有重要作用［1］.GATA-3與ERa同時高表達于luminal型乳腺癌細胞（如MCF-7、T47D），具有高度相關性，GATA-3對ER有調(diào)控作用，可能是ER通路的重要組成部分［2］.多個研究表明GATA-3在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，是乳腺癌良好預后的指標，可以通過逆轉(zhuǎn)EMT、改變腫瘤的微環(huán)境，抑制新生血管形成，負性調(diào)控多個癌基因等抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［3-4］.目前對GATA-3的研究集中在對其下游基因的探討，對其上游基因及調(diào)控機制報道較少.本研究旨在明確GATA-3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動子區(qū)域，克隆其啟動子區(qū)，并鑒定其在人乳腺癌細胞系MCF-7中的活性.為以后靶向調(diào)節(jié)GATA-3啟動子活性奠定基礎.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料

質(zhì)粒pGL3-basic、pGL3-control、pRL-SV40為筆者實驗室保存；E.coli Competent Cells DH5α感受態(tài)細胞（Takara公司）；MCF-7細胞系購自上海中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫.

1.1.2主要試劑

細胞培養(yǎng)液：DMEM-HG（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；核酸電泳所需材料：DNA ladder（中科瑞泰公司），Agarose（GIBCO公司），1×TBE電泳緩沖液，GelRED（41003 Biotium），6×Loading Buffer（Takara公司）；DNA限制性內(nèi)切酶均購自寶生物公司；質(zhì)粒制備試劑盒（minipreparation and maxipreparation）均購自天根生物有限公司（DP103，DP117）；FastPfu高保真DNA聚合酶（北京全式金生物技術有限公司AP221）；T4 DNA Ligase（北京全式金生物技術有限公司FL101）；去磷酸化酶CIP（NEB Lot：0621301）；膠回收試劑盒（Thermo Scientific GeneJET#K0691），組織、細胞DNA提取試劑盒（GENSTAR-DNAzol-D104-01），Dula-Luciferas Reporter Assay system試劑盒（Promega公司），Lipofectamine 2000（invitrogen公司）

1.2方法

1.2.1GATA-3啟動子引物設計

我們利用美國UCSC Genome Browser網(wǎng)站（http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）對GATA-3基因進行分析，在人GATA-3基因（NC_000010.11）轉(zhuǎn)錄起始位點-1 200 bp和+200 bp之間設計引物，引物設計確保克隆后的插入片段不影響Luciferase的閱讀框.合成由上海生工生物技術公司完成.上游序列：hGATA-3 pro-F 5'GCGCAAGCTTAGGGCTGG TTTCCTTGACTG 3'，酶切位點：Hind III.下游序列：hGATA-3 pro-R 5'GCGCCTCGAGGTCACCAGTACCAACCTGGG 3''，酶切位點：Xho I（下劃線序列是酶切位點）.總長度為1 191 bp.

1.2.2MCF-7細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7細胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM basic培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代，取對數(shù)生長期細胞進行試驗.

1.2.3基因組DNA提取

選擇60 cm2培養(yǎng)瓶中聚合度達到80%的MCF-7細胞，按照GENSTAR-DNAzol組織、細胞DNA提取試劑盒方法，提取基因組DNA.-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.4GATA-3啟動子擴增

以1.2.3提取的DNA為模版PCR，PCR體系如下：5×Buffer 5 μL；2.5 mM dNTP 2.5 μL；20 pmol上游引物1 μL；20 pmol下游引物1 μL；FastPfu DNA聚合酶0.25 μL；DNA模板1 μL；加滅菌水至25 μL.PCR反應條件：95℃預變性5 min，循環(huán)條件：94℃30 s，55-60℃梯度退火溫度45 s，72℃45 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min，擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察.

1.2.5構(gòu)建GATA-3啟動子pGL3-GATA-3pro-Luc

按照膠回收試劑盒的說明對PCR產(chǎn)物進行回收純化，用Hind III和Xho I進行雙酶切；同樣將載體質(zhì)粒pGL3-Basic用Hind III和Xho I進行雙酶切，并用去磷酸化酶CIP處理防止其自連；PCR產(chǎn)物與載體的連接反應按TransStart T4 DNA Ligase試劑盒說明書進行.按照插入片段與載體的摩爾比例為3∶1進行連接.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)過夜；次日搖菌提取質(zhì)粒.Hind III和Xho I進行雙酶切，陽性克隆命名為pGL3-GATA-3pro-Luc.質(zhì)粒送上海生工生物技術公司測序鑒定.

1.2.6重組質(zhì)粒pGL3-GATA-3pro-Luc轉(zhuǎn)染MCF-7細胞

在24well培養(yǎng)皿中用含有10%FBS無雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細胞到匯合度達60%進行轉(zhuǎn)染；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法分別在每孔中加入海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-SV40作為內(nèi)參，以及分別加入GATA-3啟動子報告基因pGL3-GATA-3pro-Luc/陰性對照pGL3 basic luc/陽性對照pGL3 control.在37℃，5%的二氧化碳中培養(yǎng).

1.2.7GATA-3啟動子報告基因活性檢測

上述細胞轉(zhuǎn)染24 h后裂解細胞，采用Promega公司的雙熒光報告基因檢測系統(tǒng)分別檢測實驗組和對照組的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶（內(nèi)參）活性，以兩者的活性比值作為熒光素酶的相對活性.

2　結(jié)果

2.1GATA-3啟動子基因的PCR擴增

利用設計的引物以及55-60℃梯度退火溫度（泳道1-6退火溫度遞減）PCR擴增得到的產(chǎn)物（圖1），發(fā)現(xiàn)在Marker DL2000的1 000-2 000 bp間靠近1 000 bp左右1-6個泳道均有一條特異的條帶.而我們預擴增的GATA-3啟動子部分大小約1 191 bp（加兩端酶切位點及保護堿基）.因此，從圖片結(jié)果可以看出，PCR擴增出來的條帶大小與預計的GATA-3部分啟動子大小一致，從而證明GATA-3啟動子已經(jīng)成功擴增出來，且無其他非特異性片段，對產(chǎn)物1-6泳道1%瓊脂糖凝膠分離并切膠回收.

2.2GATA-3啟動子載體的構(gòu)建及鑒定

回收經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切得到的GATA-3啟動子基因和pGL3-Basic載體的相應條帶，經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌.37℃培養(yǎng)過夜；次日搖菌提取質(zhì)粒，再以Hind III和Xhol I雙酶切后，重組質(zhì)粒釋放出1 191 bp大小左右的片段（圖2）.質(zhì)粒送經(jīng)上海生工生物工程公司測序，結(jié)果用DNAMAN軟件與GenBank基因序列進行同源性比較，證實擴增產(chǎn)物為目的基因.構(gòu)建質(zhì)粒載體命名為pGL3-GATA-3pro-Luc.

2.3GATA-3啟動子報告基因熒光素酶活性的檢測

我們把pGL3-GATA-3pro-Luc轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞中，并設pGL3 control為陽性對照，pGL3 basic為陰性對照.并共轉(zhuǎn)染相同量的海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-SV40作為內(nèi)參照，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶的比值來反應報告基因的驅(qū)動活性.結(jié)果顯示pGL3-GATA-3pro-Luc的相對熒光素酶活性為pGL3 basic的12.8倍（圖3），說明pGL3-GATA-3pro-Luc質(zhì)粒能表達熒光素酶活性代表GATA-3的啟動子活性.

3　討論

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤.在歐美國家，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤之首，約占29%，死亡率約為15%，僅次于肺癌，位居第2位［5］.乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制尚未得到十分明確的闡述，現(xiàn)在普遍認為其受多種因素與多條信號通路相互作用的結(jié)果.

圖1　55-60℃梯度退火溫度（泳道1-6退火溫度遞減）PCR擴增得到的產(chǎn)物

圖3　在MCF-7細胞株中分別轉(zhuǎn)染了同等劑量的pGL3 basic、pGL3-GATA-3pro-Luc、pGL3 control，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶的比值來反應報告基因的驅(qū)動活性.差異倍數(shù)以平均值±標準差方式給出（*，p＜0.05，t-檢驗）.

GATA-3作為轉(zhuǎn)錄因子不僅在正常乳腺組織的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)、促分化作用，而且與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關.目前的研究顯示［6］，GATA-3在乳腺癌中高表達，是乳腺癌特異性標志之一.這一點在Luminal型乳腺癌中更為明顯，并且與較好的預后相關.Marie-Liesse Asselin-Labat等［7］對luminal型乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠MMTV-PyMT的研究發(fā)現(xiàn)，缺失GATA-3等位基因會導致腫瘤形成明顯加速，而重新過表達GATA-3則能使這一過程減緩.進一步研究表明GATA-3的這一抑癌作用是通過對其下游一種抑癌基因Caspase-14的調(diào)控實現(xiàn)的。Wei Yang等［8］認為GATA-3可以通過逆轉(zhuǎn)EMT的過程抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移，而進一步的研究表明其逆轉(zhuǎn)是建立在對E-cadherin啟動子水平調(diào)控的基礎上的.Jianwei Sun等［9］認為GATA-3能消除轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ和Smad4所導致的肌成束蛋白（Fascin）的過表達從而抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，而Fascin的高表達是乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的重要機制之一.Jonathan Chou等［4］研究表明GATA-3通過調(diào)控microRNA-29b抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，而microRNA-29b可以通過作用于包括VEGFA，ANGPTL4，PDGF，LOX，MMP9，ITGA6，ITGB1和TGFB等一系列靶基因改變腫瘤的微環(huán)境，包括抑制新生血管形成，基質(zhì)破壞，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換.從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移.這一發(fā)現(xiàn)可能為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療提供新型靶點.最近的研究［10］證實GATA-3在乳腺癌中可通過形成一個轉(zhuǎn)錄抑制因子復合物GATA-3/G9A/NuRD（MTA3）下調(diào)ZEB2的表達，而鋅指蛋白ZEB2是公認的EMT的關鍵基因之一，從而最終抑制乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移.GATA-3對乳腺腫瘤的抑制作用在眾多研究中得到證實，但是對其上游基因的研究，對GATA-3本身的調(diào)控研究，在國內(nèi)外都報道較少.

本研究利用PCR方法構(gòu)建了GATA-3啟動子序列，并將其插入到pGL3 basic luc質(zhì)粒載體中，構(gòu)建了GATA-3啟動子報告基因質(zhì)粒.通過轉(zhuǎn)化擴增，篩選出陽性克隆，并通過酶切，測序鑒定及生物學活性的檢測，結(jié)果表明，本組成功地構(gòu)建了pGL3-GATA-3pro-Luc熒光素酶報告基因載體，并在MCF-7細胞內(nèi)鑒定了其熒光素酶的表達.因此，充分證明了本組構(gòu)建的pGL3-GATA-3pro-Luc是具有生物學功能的，為后續(xù)GATA-3在乳腺癌中表達及其調(diào)控通路以及以GATA-3為靶標的抗腫瘤藥物研究提供了有效工具.

［1］HOSEINK M，EUAN M，SLORACHMD，et al.GATA-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland［J］.Cell，2006，127（5）：1041-1055.

［2］LicataL A，Hostetter C L，Crismale J，et al.The RNA-binding protein HuR regulates GATA3 mRNA stability in human breast cancer cell lines［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，122（1）：55-63.

［3］Chu I M，Michalowski A M，Hoenerhoff M，et al.GATA-3 inhibits lysyl oxidase mediated metastases of human basal triple-negative breast cancer cells［J］.Oncogene，2012，31（16）：2017-2027.

［4］Chou J，Lin J H，Brenot A，et al.GATA-3 suppresses metastasis and modulates the tumour microenvironment by regulating microRNA-29b expression［J］.Nature Cell Biology，2013，15（2）：201-213.

［5］Torre L A，Bray F，Siegel R L，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［6］Yang M，Nonaka D.A study of immunohistochemical differential expression in pulmonary and mammary carcinomas［J］.Modern Pathology，2010，23（5）：654-661.

［7］Asselin-Labat ML，Sutherland K D，Vaillant F，et al.GATA-3 negatively regulates the tumor-initiatingcapacity of mammary luminal progenitor cells and targets the putative tumor suppressor caspase-14［J］.Mol Cell Bio，2011，31（22）：4609-4622.

［8］Yan W，Cao Q J，Arenas R B，et al.GATA-3 inhibits breast cancer metastasis through the reversal of epithelial-mesenchymal transition［J］.J BiolChem，2010，285（18）：14042-14051.

［9］Sun J W，He H F，Pillai S，et al.GATA-3 transcription factor abrogates Smad4-mediated fascinoverexpression invadopodiumformation and breastcancer cellinvasion［J］.JBioChem，2013；288（52）：36971.

［10］Si W Z，Huang W，Zheng Y，et al.Dysfunction of the reciprocal feedback loop between gata-3 and zeb2-nucleated repression programs contributes to breast cancer metastasis［J］.Cancer Cell，2015，27（6）：822-826.

Construction and Activity Analysis of Luciferase Reporter Gene Vector Containing GATA-3 Promoter

LIN Haoyu1，2，GUO Yuxian2，LIN Fangfang2，SUN Shuming1，LU Xiaofeng1，LIANG Weiquan1，CHEN Chunfa1
（1.DepartmentofThyroidandBreastSurgery，TheFirstAffiliatedHospital，ShantouUniversityMedicalCollege，Shantou515041，Guangdong，China；2.Changjiang Scholar's Lab，Shantou University Medical College，Shantou 515041，Guangdong，China）

Objective:GATA-3 is a transcription factor that plays crucial role in carcinogenesis and development of breast cancer，and thus the investigation of its transcription regulation is important for understanding the mechanism of breast cancer.Methods:The gene fragment of promoter sequence of GATA-3 was amplified from human breast cancer cell line MCF-7 by PCR and was cloned into empty vector pGL3-Basic to construct luciferase reporter gene vectors pGL3-GATA-3pro-Luc，which was amplified by transformation and identified by restriction enzyme digestion，sequencing，and the biological activity detecting.Results:The Slug promoter driven fluorescence protein was effectively expressed in human breast cancer cell line MCF-7.We constructed the luciferase reporter vector pGL3-GATA-3pro-Luc successfully，the expression of luciferase could be detected in human breast cancer cell line MCF-7.Conclusion:Luciferase reporter vector pGL3-GATA-3pro-Luc is constructed successfully.It lays a solid foundation for the research of GATA-3 regulation in breast cancer，and may guide to identify newtargets for breast cancer therapy.

breast neoplasm；GATA-3；Promoter；Reporter gene

R737.9

A

1001-4217（2016）03-0069-06

2015-12-17

林豪雨（1982—），男，廣東汕頭市人，博士生，主治醫(yī)師，汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺科.主要從事乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機制研究.

陳春發(fā)（1982—），男，廣東汕頭市人，碩士，主治醫(yī)師，汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺科.主要從事乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移機制研究.E-mail：zjgdmc-2001@163.com

廣東省自然科學基金資助項目（2015A030313429）；廣東省醫(yī)學科學技術基金項目（A2015437）