不同碳源對球等鞭金藻生長和細(xì)胞組成的影響

王星宇，黃旭雄，2，3

1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實驗室，上海2013062.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海2013063.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206），上海201306

不同碳源對球等鞭金藻生長和細(xì)胞組成的影響

王星宇1，黃旭雄1，2，3

1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實驗室，上海201306
2.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海201306
3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心（ZF1206），上海201306

本文研究了批次培養(yǎng)模式下培養(yǎng)基中分別添加0.018mol/L不同碳源（NaHCO3，C6H12O6，CH3COONa和CH3CH2COONa）對球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）生長、色素含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪酸組成的影響。結(jié)果表明：在鹽度26，溫度25℃，光照3000 lux條件下，f/2培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻的生長和細(xì)胞組成有顯著影響。不同碳源對球等鞭金藻促生長效果依次為：葡萄糖＞碳酸氫鈉＞空白對照＞丙酸鈉＞乙酸鈉。培養(yǎng)液中添加各種碳源均不同程度上降低了球等鞭金藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。添加碳酸氫鈉、乙酸鈉和丙酸鈉組藻葉綠素a和類胡蘿卜素含量均顯著降低，而添加葡萄糖組藻細(xì)胞中兩種色素含量顯著增加。添加碳源改變了球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成，單不飽和脂肪酸（MUFA）含量均顯著增加，而多不飽和脂肪酸（PUFA）均顯著降低。上述研究表明葡萄糖是促進(jìn)球等鞭金藻生長的高效碳源，培養(yǎng)液中添加葡萄糖是球等鞭金藻高密度培養(yǎng)的有效策略。

球等鞭金藻；碳源；葡萄糖；細(xì)胞組成

球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）由于個體小，無細(xì)胞壁，易消化，富含多糖，胡蘿卜素及高能量的脂類物質(zhì)，是世界各地水產(chǎn)養(yǎng)殖（特別是貝類養(yǎng)殖）中重要的餌料微藻［1］。金藻亦是生理活性物質(zhì)的天然寶庫，其中β-胡蘿卜素和高不飽和脂肪酸具有抗衰老、抗脅迫及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等功能。應(yīng)用生物技術(shù)篩選、提取并生產(chǎn)藻類抗衰老等生物活性物質(zhì)具有重要的潛在開發(fā)前景［2］。然而，與小球藻（Chlorella vulgaris）和螺旋藻（Spirulina platensis）相比，球等邊金藻缺乏獨(dú)特性的培養(yǎng)條件和強(qiáng)的抗污染能力，加之生長速度和培養(yǎng)密度也相對低，目前國內(nèi)外對球等鞭金藻尚未有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［3］。

微藻高密度培養(yǎng)是微藻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的前提，同時也是節(jié)約后續(xù)生產(chǎn)成本的重要手段［4］。微藻的營養(yǎng)方式一般主要以二氧化碳為碳源進(jìn)行光合自養(yǎng)，充足的二氧化碳供應(yīng)是保障微藻快速生長的必要條件［5］。王星宇［6］等發(fā)現(xiàn)在球等鞭金藻的培養(yǎng)液中添加1.5mg/m L的NaHCO3（碳濃度為0.018mol/L）也可以獲得最佳的生長性能。前人對其他微藻的研究表明，念珠藻Nostoc flagelliforme［7］、杜氏鹽藻Dunaliella salina［8］、萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardii［9］、螺旋藻Spirulina platensis［10］等微藻同時具有利用有機(jī)碳源混合營養(yǎng)生長的能力，且在混合營養(yǎng)條件下具有更大的生長及細(xì)胞密度。然而，也有報道認(rèn)為培養(yǎng)液中添加5mM和50mM有機(jī)碳（葡萄糖、果糖、乙酸鈉和甘油）會抑制球等鞭金藻CCMM 5001的生長［11］。表明不同微藻對不同碳源的利用能力存在種類特異性。本研究探討了f/2培養(yǎng)液中添加碳濃度為0.018mol/L的不同碳源對球等鞭金藻生長和細(xì)胞營養(yǎng)價值的影響，并探討最佳碳源下藻細(xì)胞組成隨培養(yǎng)時間的變化，以期為高效開發(fā)利用球等鞭金藻積累基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1藻種來源

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）來自于上海海洋大學(xué)微藻藻種室。藻種在溫度25℃，光照強(qiáng)度3000 lux，鹽度26的滅菌海水中采用采用f/2配方培養(yǎng)基［12］經(jīng)行逐級擴(kuò)大培養(yǎng)后用于試驗。

1.2培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻生長及細(xì)胞組成影響試驗

以NaHCO3，C6H12O6，CH3COONa，CH3CH2COONa為碳源，碳濃度為0.018mol/L，設(shè)置個實驗組，每組3個平行。

將擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液接種于1000m L三角燒瓶中培養(yǎng)，初始密度3×105cell/m L，將三角燒瓶置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（L：D=18：6），培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度3000 lux，鹽度26。培養(yǎng)周期10 d，定時搖瓶3次/d，培養(yǎng)期間每日定時取樣計數(shù)藻細(xì)胞密度。藻細(xì)胞密度的測定采用XB-K-25血球計數(shù)板計數(shù)法，每個樣品平行測定4次。

培養(yǎng)結(jié)束時，搖勻取30m L藻液經(jīng)混合纖維素酯濾膜（孔徑為0.45μm）過濾，置于烘箱中105℃烘干至恒重，得到細(xì)胞干重。另搖勻取1m L藻液加入1m L 2N NaOH，95℃水浴10m in，冷卻至室溫，加入1m L 1.6N HCl中和，離心后取上清，采用福林-酚試劑測定蛋白質(zhì)含量［13］。取20m L藻液用于細(xì)胞葉綠素a和類胡蘿卜素含量的測定。剩余藻液經(jīng)離心后，冷凍干燥用于脂肪酸組成的測定。

葉綠素a的含量采用分光光度法測定［14］。取20m L藻液，10000 rpm離心5min去上清，再加等量蒸餾水重新懸浮后離心去上清；離心得到的藻泥在黑暗條件下，用超聲波破碎儀在冰浴條件下破碎10min，加3m L純甲醇45℃水浴黑暗靜置35min，中間可振搖1次，依據(jù)浸提情況可適當(dāng)延長浸提時間；再次離心取上清，用純甲醇作參比，分別在750、665、652和480 nm處，使用1m光徑的比色皿測定吸光值。其中，750 nm處的吸光值用以校正提取液的渾濁度，分別將665，652和480 nm處測定溶液的吸光度值減去750 nm下的吸光度值，得到校正后的A665、A652、A480。葉綠素a濃度的測定參考J.Ritchie［15］的計算公式；類胡蘿卜素濃度的測定參考Strickland和Parsons［16］的計算公式：

［Chl-a］ug/m L=（-8.0962×A652+16.5169×A665）×提取液體積m L/藻液用量m L/比色皿光程cm

［Carotenoids］ug/m L=4×A480×提取液體積m L/藻液用量m L/比色皿光程cm

根據(jù)測定的濃度和單位體積內(nèi)的藻細(xì)胞的生物量折算成色素含量（mg/g）。

1.3培養(yǎng)時間對球等鞭金藻生長及細(xì)胞組成影響試驗

根據(jù)1.2試驗結(jié)果，篩選出5組中球等鞭金藻生長密度最高組（C組-C6H12O6）為放大試驗組，將擴(kuò)大培養(yǎng)后的藻液接種于60 L柱狀氣升式光生物反應(yīng)器（高1m，直徑0.3m）中培養(yǎng)，初始接種密度3×106cell/m L。反應(yīng)器中內(nèi)置LED光源，光照強(qiáng)度2500 lux，連續(xù)光照，室溫培養(yǎng)。培養(yǎng)周期10 d，培養(yǎng)期間每日定時取樣計數(shù)藻細(xì)胞密度，隔天定期收獲5 L藻液用于細(xì)胞蛋白和脂肪酸組成的測定。

1.4脂肪酸的測定

細(xì)胞脂肪酸組成的測定參照Griffiths［17］等的方法，移取一定量藻粉依次加入甲醇鈉（NaOMe，0.5 mol/L）和BF3-甲醇溶液（14%）進(jìn)行兩步甲酯化，提取含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯混合物，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。然后采用氣-質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 7890A/5975C）分析脂肪酸甲酯，毛細(xì)管柱為Supelco Omegawax320（30.0×0.32mm×0.25μm）。根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，美國）的分析圖譜和保留時間對樣品脂肪酸定性分析，利用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對百分含量［18］，每組樣品平行測量3次。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件（SPSS Inc.，USA）進(jìn)行單因子方差分析（One-Way ANOVA），并用Duncan氏檢驗進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平為P＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻生長及細(xì)胞組成影響

培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻生長的影響如圖1所示。在培養(yǎng)前4 d，碳源的添加與否對球等鞭金藻細(xì)胞生長無顯著影響（P＞0.05）。培養(yǎng)到第5 d，不同碳源對藻細(xì)胞生長的影響開始顯現(xiàn)，但組間差異不顯著（P＞0.05）；之后，乙酸鈉（D）組、丙酸鈉（E）組和空白對照（A）組的細(xì)胞密度出現(xiàn)下降趨勢，而葡萄糖（C）組和碳酸氫鈉（B）組藻細(xì)胞則依然呈增長趨勢。培養(yǎng)第9 d，C組藻細(xì)胞密度顯著高于B、A、D和E組（P＜0.05），且C和B組藻細(xì)胞密度分別達(dá)到最大值，其中C組最大密度為7.60×106cell/m L，B組最大密度為3.28×106cell/m L。培養(yǎng)第10 d，各組藻細(xì)胞密度均較前一日有所下降。

圖1　培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻生長的影響Fig.1Effectof different carbon resourceson grow th of them icroalgae Isochrysisgalbana

經(jīng)過10 d培養(yǎng)，培養(yǎng)液中不同碳源對藻細(xì)胞色素含量有顯著影響（P＜0.05）（圖2）。葡萄糖（C）組藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著高于對照（A）組（P＜0.05），碳酸氫鈉（B）組、乙酸鈉（D）組和丙酸鈉（E）組藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著低于對照（A）組（P＜0.05），D組藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著低于其他組（P＜0.05）。藻細(xì)胞中類胡蘿卜素含量也呈現(xiàn)與葉綠素a類似的變化規(guī)律。

圖2　培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻細(xì)胞色素含量的影響Fig.2Effectsof different carbon resourceson pigment content in Isochrysisgalbana cells

經(jīng)過10 d培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加不同碳源后藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量較對照組（A）顯著降低（P＜0.05）（圖3）。在相同的碳源添加量下，藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量從高到低依次為葡萄糖（C）組＞丙酸鈉（E）組＞碳酸氫鈉（B）組＞乙酸鈉（D）組。乙酸鈉（D）組藻細(xì)胞蛋白含量顯著低于其他組（P＜0.05），而葡萄糖（C）組和丙酸鈉（E）組無顯著差異（P＞0.05）。

圖3　培養(yǎng)液中添加不同碳源對球等鞭金藻蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3Effectsof different carbon resourceson protein content in Isochrysisgalbana

從各處理組球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成（表2）可知，球等鞭金藻細(xì)胞中主要的脂肪酸為18：1n9、16：0、18：4n3、14：0和22：6n3。培養(yǎng)液中添加不同碳源對藻細(xì)胞的脂肪酸有不同的影響。

與對照（A）組相比，添加碳酸氫鈉（B）組藻細(xì)胞14：0、18：4n3和多不飽和脂肪酸（PUFA）含量顯著降低（P＜0.05）；16：0、18：1n9、22：6n3和單不飽和脂肪酸（MUFA）含量顯著增加（P＜0.05）；飽和脂肪酸（SFA）含量無顯著變化（P＞0.05）。

與對照（A）組相比，添加葡萄糖（C）組藻細(xì)胞14：0、18：4n3和PUFA含量顯著降低（P＜0.05）；18：1n9、22：6n3和MUFA含量顯著增加（P＜0.05）；SFA含量無顯著變化（P＞0.05）。

與對照（A）組相比，添加乙酸鈉（D）組藻細(xì)胞14：0、18：4n3和PUFA含量顯著降低（P＜0.05）；18：1n9、20：5n3和MUFA含量顯著增加（P＜0.05）；22：6n3和SFA含量無顯著變化（P＞0.05）。

與對照（A）組相比，添加丙酸鈉（E）組藻細(xì)胞14：0、18：4n3、SFA和PUFA含量顯著降低（P＜0.05）；18：1n9、20：5n3和MUFA含量顯著增加（P＜0.05）。

表2　培養(yǎng)液中添加不用碳源對球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成的影響Table2Effectsof different carbon resourceson fatty acid profiles in Isochrysisgalbana cells

2.2培養(yǎng)時間對添加碳濃度為0.018mol/L C6H12O6的球等鞭金藻生長和細(xì)胞組成的影響

圖4所示為添加碳濃度為0.018mol/LC6H12O6條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應(yīng)器中的生長曲線。可知，1～9 d藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時間的增長而增加，在第9 d藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值，為5.26×106cell/m L。之后細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低。

圖4　添加C6H12O6條件下球等鞭金藻在60 L光生物反應(yīng)器中的生長曲線Fig.4 The grow th curve of Isochrysisgalbana supp lemented w ith C6H12O6in 60 L bioreactor

培養(yǎng)階段對球等鞭金藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量有顯著影響（P＜0.05）（圖5）。藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先升后降的變化。第7 d藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量顯著高于其他時間點(diǎn)（P＜0.05）。

圖5　培養(yǎng)時間對添加C6H12O6的球等鞭金藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5Effectsof grow th phaseson protein content of Isochrysisgalbana supp lemented w ith C6H12O6

由不同培養(yǎng)階段球等鞭金藻脂肪酸組成可知，在添加0.018mol/LC6H12O6條件下，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，18：1n9和18：2n6含量逐漸增加，14：0、16：0、18：3n-3、18：4n-3和22：6n3含量顯著減少；20：5n3含量先增后減；SFA含量逐漸減少，MUFA含量逐漸增加，PUFA含量則顯著減少（表3）。

表3　培養(yǎng)時間對添加C6H12O6的球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸組成的影響Table3Effectsof grow th phaseson fatty acid profiles in Isochrysisgalbana supp lemented w ith C6H12O6

3　討論

混合營養(yǎng)（M ixotrophism）是指同時進(jìn)行無機(jī)營養(yǎng)光合作用與有機(jī)營養(yǎng)的現(xiàn)象。通過混合營養(yǎng)培養(yǎng)可以大規(guī)模高密度生產(chǎn)微藻。已有學(xué)者研究了微藻的混合營養(yǎng)生長特點(diǎn)［19，20］。本研究中，培養(yǎng)液中添加碳濃度為0.018mol/L的不同碳源對球等鞭金藻的生長、色素含量、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量和脂肪酸組成有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻3011的兼養(yǎng)生長對不同碳源具有選擇性。

培養(yǎng)液中添加碳酸氫鈉對球等鞭金藻的生長有顯著影響，王星宇［6］等的研究中也得到了證實，類似的結(jié)果在White［21］等的研究中均有發(fā)現(xiàn)，添加1 g/L碳酸氫鈉，可以提高四爿藻（Tetraselmis suecica）和微綠球藻（Nannochloropsissalina）培養(yǎng)的細(xì)胞密度。戴玉蓉［22］的研究發(fā)現(xiàn)，在綠色巴夫藻3012（Pavlova viridis）、等鞭金藻3011、等鞭金藻8701、亞心扁藻（Platymonassubcordiformis）和海水小球藻（Chlorella pacifica）中添加1 g/LNaHCO3對這5種單細(xì)胞藻類的生長均有明顯的促進(jìn)作用。研究表明，水體中的微藻只能吸收利用CO2和HCO3-［23］。二氧化碳可以自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而為微藻細(xì)胞的光合作用所利用；HCO3-既可以直接轉(zhuǎn)運(yùn)也可間接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中為微藻細(xì)胞所利用［24］。然而，在正常海水中，因其pH呈堿性（約8.1左右），超過90%的可溶性無機(jī)碳是以HCO3-形式存在的。微藻對環(huán)境中的HCO3-利用存在兩種機(jī)制［25，26］：一方面，微藻能夠從外界環(huán)境中跨質(zhì)膜運(yùn)輸HCO3-到胞液中，然后在胞液內(nèi)通過胞內(nèi)碳酸酐酶的作用將HCO3-分解成CO2供光合作用所需。另一方面，有些微藻分泌的細(xì)胞外的碳酸酐酶也可以將環(huán)境中的HCO3-催化成CO2，然后CO2跨膜被藻細(xì)胞利用。

對于具有混合營養(yǎng)功能的微藻而言，在培養(yǎng)基內(nèi)添加有機(jī)碳，可促進(jìn)微藻的生長和胞內(nèi)物質(zhì)的含量。本文中，培養(yǎng)液中添加葡萄糖對球等鞭金藻的生長有明顯促進(jìn)作用，使球等鞭金藻細(xì)胞密度增加了370%。培養(yǎng)液中添加葡萄糖對微藻生長的促進(jìn)作用在其他微藻中也得到了證實。徐芳等［27］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)碳濃度為30mmol/L時，葡萄糖對微綠球藻（Nannochloropsis sp.）的生長有促進(jìn)作用。王榮榮［9］等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入葡萄糖明顯的促進(jìn)了萊茵衣藻（Chlamydomona s reinhardtii）的生長，且葡萄糖作為能量物質(zhì)和原料對細(xì)胞分裂的影響更大。馬為民［28］等的研究表明綠色微囊藻（Microcystisviridis）在添加葡萄糖的混合營養(yǎng)條件下生長速率和生物量明顯提高。田華［29］等在研究以葡萄糖為碳源對螺旋藻（Spirulina platensis）混合營養(yǎng)條件下培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，葡萄糖濃度為3.0 g/L時，干重是對照的1.29倍。培養(yǎng)液中添加葡萄糖促進(jìn)藻類生長的機(jī)理，有學(xué)者認(rèn)為葡萄糖既作為細(xì)胞生長的能源，又作為細(xì)胞生長的碳源，甚至葡萄糖本身或葡萄糖的某一種間接代謝產(chǎn)物可能成為細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)和刺激物質(zhì)，因此外源葡萄糖對細(xì)胞的生理和代謝產(chǎn)生影響，使整個細(xì)胞處于比較活躍的生理狀態(tài)［30］。混合營養(yǎng)條件下細(xì)胞葡萄糖激酶的活力明顯高于光合自養(yǎng)條件下的葡萄糖激酶的活性，有機(jī)碳源被微藻細(xì)胞攝入后，將參與到細(xì)胞的代謝，有機(jī)碳源的利用會影響細(xì)胞初級代謝的流動狀況，磷酸戊糖途徑氧化性分支的反應(yīng)過程明顯加強(qiáng)，并隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，有機(jī)碳源被細(xì)胞用作碳源的比例可能減小，而用作能源的比例有所增加，葡萄糖的氧化釋放CO2彌補(bǔ)了氣體碳源CO2供應(yīng)的不足，并可能使細(xì)胞在碳源利用中所消耗的ATP和NADPH有所節(jié)省，最終導(dǎo)致光合反應(yīng)速率增加、光飽和值升高、暗呼吸和光補(bǔ)償點(diǎn)也顯著提高，藻生物量濃度較光合自養(yǎng)有很大程度提高［29］。

本研究中，在培養(yǎng)液中添加碳濃度為0.018mol/L的乙酸鈉或丙酸鈉對球等鞭金藻的生長有抑制作用。徐芳等［27］研究微綠球藻（Nannochloropsis sp.）的兼養(yǎng)生長時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)碳濃度為30mmol/L，乙酸鈉不能促進(jìn)藻細(xì)胞的生長。有研究表明，乙酸鈉對微藻生物量促進(jìn)作用具有適宜的濃度范圍，乙酸鈉濃度過高會嚴(yán)重抑制藻細(xì)胞的生長［31，32］。魚腥藻7120［33］，微綠球藻Nannochloropsis sp.［34］，萊茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii［35］等微藻已證實不能利用乙酸鈉。Chen等認(rèn)為如果在養(yǎng)殖系統(tǒng)中加入具有強(qiáng)離子性的有機(jī)物（如乙酸鈉），培養(yǎng)液中的離子濃度就會增加，這就會明顯的抑制微藻的生長［36］。然而，龍元薷［37］等研究發(fā)現(xiàn)混合營養(yǎng)條件下0.5～1.5 g/L的乙酸鈉對雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）的生長有明顯促進(jìn)作用。劉曉娟等［38］研究發(fā)現(xiàn)乙酸鈉濃度為100～400mmol/L時靜置培養(yǎng)的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的生物量較空白組顯著提高。黃振華等［39］研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中添加0.5～10 g/L的乙酸鈉對湛江等鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）的生長均促進(jìn)作用。劉茜［40］的研究發(fā)現(xiàn)丙酸鈉對小球藻（Chlorella vulgaris）生長有促進(jìn)作用。上述研究表明，培養(yǎng)液中添加乙酸鈉或丙酸鈉是否能促進(jìn)微藻的生長，不但與其添加劑量有關(guān)，還與微藻種類特異性有關(guān)。

而在細(xì)胞色素方面，以NaHCO3，CH3COONa和CH3CH2COONa為碳源的實驗組中，細(xì)胞色素含量均顯著降低，但以C6H12O6為碳源，細(xì)胞色素含量卻顯著增加。可能原因是，在光反應(yīng)階段，培養(yǎng)液中加入NaHCO3不能增加球等鞭金藻捕獲光的能力，但卻加強(qiáng)了固定CO2形成葡萄糖的暗反應(yīng)階段，有機(jī)物的積累使得藻細(xì)胞密度增加。而在培養(yǎng)液中加入葡萄糖，藻細(xì)胞可以直接利用葡萄糖，同時既加強(qiáng)了光反應(yīng)也加強(qiáng)了暗反應(yīng)，體現(xiàn)在細(xì)胞密度的增長和葉綠素含量的增加。田華［41］等在研究葡萄糖對螺旋藻葉綠素含量的影響中發(fā)現(xiàn)，在混合營養(yǎng)培養(yǎng)中，由于添加葡萄糖，螺旋藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)代謝活躍，葡萄糖的氧化利用為細(xì)胞提供部分電子流流向PSⅠ，葉綠素因PSⅠ加強(qiáng)，吸收較多光能，體現(xiàn)在色素積累量上即為混合營養(yǎng)分批培養(yǎng)中葉綠素較光合自養(yǎng)含量高。

以NaHCO3，C6H12O6，CH3COONa，CH3CH2COONa為碳源，藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量都有不同程度的降低，單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著增加；而多不飽和脂肪酸（PUFA）顯著降低。而孫俊楠［8］等在杜氏鹽藻培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的累積量和培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量與培養(yǎng)液中藻體的濃度有一定關(guān)系，藻體濃度高，則蛋白質(zhì)累積量也高.這也說明以葡萄糖為碳源的混合營養(yǎng)條件培養(yǎng)對微藻類的蛋白質(zhì)積累具有種的特異性。藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低的原因，推測與培養(yǎng)液中C/N比增大有關(guān)。培養(yǎng)液中高的C/N比在某種程度上意味著N的相對缺乏，而氮缺乏會抑制藻細(xì)胞合成蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)而將能量以脂類和碳水化合物的形式貯存在細(xì)胞中［42］。微藻對葡萄糖的分解利用是通過糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑進(jìn)行的，三羧酸循環(huán)是在線粒體中完成的，是糖的徹底氧化脫羧過程。微藻對乙酸鈉的利用途徑主要是乙醛酸循環(huán)，與葡萄糖的三羧酸循環(huán)雖然存在著某些相同的酶類和熱間產(chǎn)物，但乙醛酸循環(huán)是在乙醛酸體中進(jìn)行的，是與脂肪轉(zhuǎn)化為糖密切相關(guān)的生化過程［43］。

在柱狀光生物反應(yīng)器中加入0.018mol/LC6H12O6對球等鞭金藻的兼性培養(yǎng)試驗中，藻細(xì)胞最大密度為5.26×106cell/m L，并未達(dá)到之前在錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)時的7.60×106cell/m L，故利用光反應(yīng)器培養(yǎng)微藻存在一些限制因素：在微藻達(dá)到較高的細(xì)胞密度時，光強(qiáng)一定，由于藻細(xì)胞之間相互遮蔽，限制了光的穿透，單個藻細(xì)胞獲得的光能減少，一定程度上降低了藻的生長速度和細(xì)胞密度的上限。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞蛋白質(zhì)含量增加，MUFA含量逐漸增加，SFA和PUFA含量顯著減少。培養(yǎng)階段影響藻細(xì)胞生化組成與培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽的變化有關(guān)。由于藻類生長過程中不斷吸收利用培養(yǎng)液中的營養(yǎng)鹽，導(dǎo)致營養(yǎng)鹽的缺乏有關(guān)。而營養(yǎng)鹽缺乏，尤其是氮的缺乏，引起藻細(xì)胞生化組成變化的顯著特點(diǎn)為細(xì)胞蛋白質(zhì)含量降低，脂肪含量增加，飽和脂肪酸增加，多不飽和脂肪酸脂肪酸降低［42］。

綜上所述，一次性培養(yǎng)模式下，培養(yǎng)液中添加碳濃度為0.018mol/L的NaHCO3和C6H12O6可以提升球等鞭金藻生長性能。添加NaHCO3可提高22：6n3含量和單不飽和脂肪酸（MUFA）含量，添加C6H12O6可提升細(xì)胞色素含量、22：6n3含量和單不飽和脂肪酸（MUFA）含量。

所以，培養(yǎng)液中添加C6H12O6有望對球等鞭金藻高密度培養(yǎng)，工業(yè)化生產(chǎn)及提取并生產(chǎn)藻類抗衰老生物活性物質(zhì)（β-胡蘿卜素）提供有效策略。

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Effect of Different Carbon Sources on Growth and Biochemical Composition of Isochrysis galbana

WANG Xing-yu1，HUANG Xu-xiong1，2，3
1.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheryGermplasm ResourcesofMinistryofAgriculture/ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China
2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquaculture，Shanghai201306，China
3.Collaborative InnovationCenterin Shanghai/AquaticAnimalGeneticBreedingCenter（ZF1206），Shanghai201306，China

This paper studied the effect of adding 0.018mol/L of NaHCO3，C6H12O6，CH3COONa and CH3CH2COONa into medium respectively on the grow th，cellular pigmentand protein contents and fatty acid profiles of them icroalgae Isochrysis galbana under a batch culturemodel.The results showed therewas a significant influence to add different carbon compounds into f/2 medium under temperature 25℃，light intensity 3000 lux，salinity 26.The grow th promoting effect of the carbon sourceswere as follows：glucose＞NaHCO3＞CH3CH2COONa＞CH3COONa.The cellular protein contents inmicroalgae decreased when the carbon sources were supplemented in the medium.The treatments supplemented NaHCO3，CH3CH2COONa and CH3COONa displayed significant low Chlorophyll a and Carotenoids contents.The treatments supplemented glucose displayed significant low chlorophyll a and carotenoids contents.The fatty acid profiles of the microalgae also changed when different carbon sourceswere added into themedium.Themonounsaturated fatty acids content increased while polyunsaturated fatty acids content decreased significantly.It was therefore suggested that glucose was an effective carbon source for improving the grow th of themicroalgae and could beapplied in the production ofmicroalgae.

Isochrysisgalbana；carbon source；glucose；cellular profiles

Q949.2

A

1000-2324（2016）04-0506-08

2015-02-11

2015-03-23

上海市科技興農(nóng)項目（滬農(nóng)科推字（2013）第2-1號）；上海市科技興農(nóng)項目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-2號）；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目資助

王星宇（1994-），男，本科生，研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與生物餌料.E-mail：Robsten8@126.com

*通迅作者：Author for correspondence.E-mail：xxhuang@shou.edu.cn