一株煙草根際溶磷細菌的篩選鑒定及其培養基優化

劉虎，侯貞，易建華，周東波，周曙光，劉凱，汪城墻，丁延芹，杜秉海*

1.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室，山東泰安2710182.湖南中煙工業有限責任公司技術研發中心，湖南長沙410007

一株煙草根際溶磷細菌的篩選鑒定及其培養基優化

劉虎1，侯貞1，易建華2*，周東波2，周曙光2，劉凱1，汪城墻1，丁延芹1，杜秉海1*

1.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室，山東泰安271018
2.湖南中煙工業有限責任公司技術研發中心，湖南長沙410007

溶磷微生物可以加速土壤磷素循環，促進植物生長，具有較好的應用前景。本試驗以無機磷為唯一磷源的選擇性培養基從煙田土壤中篩選具有溶磷功能的細菌，同時分別運用鉬銻抗顯色法、Salkowski顯色法對其溶磷能力、產IAA能力進行檢測。通過生理生化特征和16S rRNA測序對溶磷效果較好的菌株JP6進行鑒定。通過模擬試驗驗證JP6對土壤中有效磷釋放的影響；運用單因子試驗確定最佳碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽，并通過正交試驗進行培養基配比優化。結果顯示：菌株JP6具有較好的溶磷能力，發酵液中有效磷含量為50.1mg/L，同時該菌株具有產IAA能力，在R2A培養基中分泌IAA含量為128.9μg/m L，通過生理生化和16S rRNA序列比對將JP6鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），在土壤中具有較好的溶磷作用，最佳培養基配比為在10%黃豆芽基礎上1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5%CaCO3。

溶磷細菌；陰溝腸桿菌；篩選；鑒定；培養基優化

磷素是植物生長所需的重要元素，可以促進細胞分裂，提高植物的抗旱能力，同時影響植物的光合作用［1，2］以及呼吸作用。磷素在土壤中廣泛存在，施用磷肥的70%～90%被固定在土壤中變成無效磷，無法被植物利用［3，4］。大量使用磷肥會增加生產成本，引起環境污染，同時會降低農產品的品質，土壤板結［5］。具有溶磷能力的植物根際促生細菌（PGPR）能夠將土壤中難溶性磷轉化為有效磷，為植物提供養分［6］；產生長素也是PGPR直接促生機制之一［7］。細菌分泌的3-吲哚乙酸（IAA）可以增強細胞的滲透吸水能力［8］，也會激發植物自身激素的分泌，從而促進植物的生長，但是也有報道單純具有產IAA功能的菌株對作物的促生效果不明顯［9］。因此利用土壤微生物的生命活動加速土壤中的磷素循環、提高植物磷素利用率，同時利用細菌產生長素共同促進植物生長具有良好的應用前景。

文獻報道的溶磷細菌有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、產堿菌屬（Alcaligenes）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、固氮菌屬（Azotobacter）、歐文氏菌屬（Erwinia）、沙雷氏菌（Serratia）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、腸細菌屬（Enterbacter）、微球菌屬（Micrococcus）、沙門氏菌屬（Salmonella）、色桿菌屬（Chromabacterium）、節細菌屬（Arthrobacter）、埃希氏菌屬（Escherichia）、布克氏菌屬（Burkholderia）、勞爾氏菌屬（Ralastonia）、泛菌屬（Pantoea）、不動桿菌屬（Acinetobacter）［10-15］。陸瑞霞［16］，李曉舉［17］和李明新［18］已報道陰溝腸桿菌具有溶磷功能，但是同時具有溶磷和產生長素功能的陰溝腸桿菌少有報道。

本研究利用無機磷培養基在湖南瀏陽煙科所煙田土壤中篩選出一株同時具有溶磷和產生長素功能的陰溝腸桿菌，同時對JP6進行土壤溶磷模擬試驗和培養基優化試驗，為該菌的工業化生產和田間應用提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣土樣取自湖南省瀏陽煙科所煙田煙草根際，存于密封袋中，4℃保存。

1.1.2培養基與試劑無機磷液體培養基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO40.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g；CaCO35.0 g，KCl0.3 g，Ca3（PO4）210 g，蒸餾水定容至1000m L，pH值7.2～7.4。其中Ca3（PO4）2單獨稱量，每100m L分裝1 g。121℃滅菌20min。

無機磷固體培養基：同上添加瓊脂18～20 g。

R2A培養基：酵母粉0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酪蛋白氨基酸0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，丙酮酸鈉0.3 g溶于1 L水中，用K2HPO4和KH2PO4將pH調至7.2，121℃滅菌20min。

初始發酵培養基：黃豆芽100 g，蔗糖50 g，pH自然。新鮮黃豆芽100 g，加水100m L，煮沸30min，用紗布過濾。用水補足原量，再加入蔗糖50 g，煮沸溶化。121℃滅菌20m in。

LB培養基：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1000m L pH 7.0，121℃滅菌20min。

Salkowski顯色液：500m L 35%HClO4，10m L 0.5mol/L FeCl3。

1.2方法

1.2.1溶磷菌的分離純化稱新鮮土壤10 g，置于內含玻璃珠和90m L無菌水的250m L三角瓶中，170 r/min振蕩30min，然后系列梯度稀釋，將10-5、10-6、10-7梯度取0.1m L涂布于無機磷培養基平板上，每個梯度重復3次，置于28℃培養24～48 h。采用溶磷圈方法［19］篩選，挑取產生透明圈的分離物進行純化。將純化的細菌分離物點接到無機磷培養基上，28℃，培養4 d，測定溶磷圈直徑D，菌落直徑d，并測量溶磷比（溶磷圈直徑/菌落直徑），篩選出效果較好的菌株。

1.2.2溶磷菌發酵液有效磷含量測定采用鉬銻抗顯色方法［20］對初篩效果較好的菌株進行溶磷能力測定。具體操作如下：（1）繪制標準曲線：在6個50m L容量瓶中分別加入0m L、0.1m L、0.2m L、0.3 m L、0.4m L、0.5m L的100mg/m L的磷標準溶液，加2滴2，6-二硝基苯酚作為指示劑，加鉬銻抗顯色劑5m L，定容至刻度，使標準磷濃度分別為0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L，搖勻。在室溫下反應30m in后，用紫外分光光度計在720 nm處比色，根據結果繪制標準曲線。（2）發酵液制備：將活化好的菌株接種到LB斜面培養基上，37℃培養2 d。將生長好的菌苔用無菌水進行適當稀釋，制成108cfu/m L菌懸液。按1%接種量接至50m L液體溶磷培養基中，對照以無菌水代替，每處理5個平行，180 r/m in，30℃，搖床中培養4 d。（3）測定方法：將發酵液轉移至離心管，超聲波細胞粉碎處理20m in；4000 rpm/m in，離心20min后吸取上清液待測；吸取適量上清液于50m L容量瓶中，用水稀釋至總體積約3/5處，加入2～3滴2，4-二硝基酚，并調pH至溶液剛呈微黃色，加入5m L鉬銻抗試劑，搖勻，加水定容，室溫放置30m in，720 nm處比色。根據標準曲線算出磷濃度，并計算發酵液中有效磷含量。

1.2.3產IAA能力測定采用Salkowski顯色方法［21］，計算菌濃度OD600值為1時，單位體積發酵液中IAA含量；標準曲線由100μg/m L的分析純IAA標準液系列稀釋0，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg/m L，顯色方法同上，分光光度法測定OD530，以OD530為橫坐標，IAA濃度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4溶磷菌株的鑒定溶磷菌的16S rRNA鑒定：對純化的菌株進行液體培養，利用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司生產）提取細菌總DNA。采用細菌通用引物27F/1492R進行PCR擴增。PCR擴增體系為25μL體系：10×緩沖液2.5μL，Taq酶0.5μL，dNTPs2μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 18μL。反應程序設定為95℃預變性5m in；94℃變性50 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5min，循環次數30次，72℃再延伸10m in，4℃保存。將PCR擴增產物送往上海鉑尚生物公司測序。測序結果使用NCBI數據庫比對，并構建系統進化樹。

生理生化鑒定：將菌株接種到LB固體培養基上，37℃培養24 h，對菌株進行菌落形態描述，并根據《常用細菌系統鑒定手冊》［22］對菌株進行革蘭氏染色以及生理生化鑒定。

1.2.5模擬條件下JP6對土壤有效磷釋放的影響取250 g研磨過篩后的土于250m L三角瓶中，接種培養至對數期的JP6菌液，每瓶按18%接種量添加于上述三角瓶中混勻，調整土壤濕度為最大持水量的60%，然后用棉塞封閉三角瓶，在培養箱中25℃避光培養，每20 d取樣1次，測定土壤中有效磷含量，測定方法參照《土壤農化分析》［23］。

1.2.6培養基優化將活化好的菌種接種到LB培養基，37℃，190 r/m in，搖床培養10 h，制成種子液。

（1）單因子試驗：最佳碳源的篩選：在初始發酵培養基中分別加入2%蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為碳源替代蔗糖50 g，按0.2%的接種量向培養基中接種種子液，37℃，190 r/min，搖床培養15 h，測定OD600的吸光值。

最佳有機氮源的篩選：在發酵培養基中分別加入1%氮源（蛋白胨、酵母粉、豆餅粉作為氮源，碳源為最佳碳源，發酵條件同上。

最佳無機氮源的篩選：在發酵培養基中分別加入0.5%的尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl作為無機氮源，同時加入相應的最佳碳源和最佳有機氮源，發酵條件同上。

最佳無機鹽篩選：在發酵培養基中分別加入0.3%的MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCO3作為無機鹽，同時加入相應的最佳碳氮源，發酵條件同上。

（2）正交試驗根據單因子試驗結果，選取有利于菌體生長的碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽進行正交試驗。

確定最佳組合后，接種0.2%種子液，37℃，190 r/m in，培養24 h，采用稀釋涂布平板法進行菌落計數。

2　結果與分析

2.1溶磷菌的篩選

從土壤樣品中共分離得到15個具有溶磷功能的細菌分離物。選擇溶磷能力較好的一株細菌分離物標記為JP6。JP6的溶磷圈直徑D為13mm，菌落直徑d為5.0mm，溶磷比D/d為2.6。JP6在無機磷培養基上的效果圖見圖1。

圖1　JP6在無機磷培養基上的溶磷圈Fig.1Phosphorus solubilizing halo of JP6 on inorganic phosphorusmedium

2.2功能測定

溶磷能力測定：利用鉬銻抗比色法對JP6菌株的溶磷能力進行定量測定，測得28℃培養7 d的發酵液中的有效磷含量達到50.1mg/L。

產IAA能力測定：經Salkowski顯色方法測得JP6菌株28℃在R2A培養基中培養4 d的發酵液中的IAA含量達到128.9μg/m L。

2.3JP6菌株鑒定

2.3.1生理生化實驗JP6的菌體為短桿狀，菌體長為6.5～8.7μm。經革蘭氏染色發現JP6菌株為革蘭氏陰性菌。JP6在LB固體培養基上的菌落特征為：圓形，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，凸起，易于挑取。JP6的部分生理生化指標見表1。JP6與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）模式種的生理生化具有相同特征，由各項生理生化推斷JP6可能為陰溝腸桿菌。

表1　生理生化檢測Table 1 Physiologicaland biochem ical test

2.3.216s rRNA鑒定

圖2　JP6系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of JP6

對16S rRNA序列進行測序后，將序列提交至GenBank中，獲得序列號（KU160628），在NCBI中進行BLAST比對發現JP6菌株的16S rRNA序列與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（JQ038222.1）相似度為99%。由圖2系統發育樹可以看出JP6菌株與陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（JQ038222.1）同處最小的一個分支，進化距離較近，綜合生理生化指標將JP6菌株鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae）。

2.4模擬條件下JP6對土壤有效磷釋放的影響

圖3　有效磷含量隨天數變化Fig.3 Phosphorus content changesw ith the days

對照組CK和JP6組的模擬試驗結果（圖3）顯示：與初始土壤相比，前60 d土壤中的有效磷含量減少。60 d以后CK和JP6組的有效磷含量開始增加。其中CK組的土壤有效磷含量增加緩慢，JP6處理組在80 d時土壤有效磷含量高于CK，并且超過初始值。CK組在100 d和120 d時有效磷含量也高于初始值。與對照相比，JP6組80 d、100 d的有效磷含量分別增加2.16%、2.59%；120 d時，JP6組土壤中的有效磷含量在0.05水平上顯著高于CK組，與CK相比，JP6的有效磷含量增加9.84%。

2.5培養基優化

2.5.1單因子試驗

表2　碳源的優化Table 2Optim ization of carbon source

根據發酵液在600 nm處的吸光度值可以對細菌生長量做一個初步判斷。表2顯示不同碳源的OD600值大小為葡萄糖＞乳糖＞蔗糖＞麥芽糖＞玉米粉＞可溶性淀粉，所以JP6的最佳碳源為葡萄糖。

表3　氮源優化Table 3Optim ization for nitrogen source

發酵15 h后對發酵液進行OD600的測定，3種有機氮源的OD600值大小為：酵母粉＞豆粕＞蛋白胨，確定JP6的最佳有機氮源為酵母粉。由于JP6在酵母粉和豆餅粉中的生長量相差不大，同時考慮到生產成本，所以選擇豆粕作為最佳有機氮源。

在無機氮源的選擇中發現NH4Cl的OD600值要高于（NH4）2SO4、尿素、NH4NO3，故此確定JP6的最佳無機氮源為NH4Cl。

表4　無機鹽優化Table 4Optim ization of inorganic salt

在確定最佳碳源和氮源的基礎上對無機鹽進行優化，在豆芽汁培養基中分別加入0.3%的MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、CaCO3。對OD600的值進行比較，發現CaCO3＞KH2PO4＞K2HPO4＞MgSO4。由此可以看出JP6的最佳無機鹽為CaCO3。

2.5.2正交試驗根據單因子試驗確定的最佳碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽，選取葡萄糖（A），豆粕（B），NH4Cl（C），CaCO3（D）進行4因素3水平正交試驗，試驗設計如表5所示。

表5　正交試驗設計Table5Orthogonalexperimentaldesign

表6　正交試驗結果Table6 The resultsof orthogonalexperiment

對正交試驗結果進行極差分析可以得出四種因素的極差值大小排列為RA＞RD＞RC＞RB（見表6），可以判斷影響發酵液中JP6菌體數量的主要因素是葡萄糖（A），其次為CaCO3（D）和NH4Cl（C），豆粕（B）影響最小。

根據正交試驗所得的K值大小可以確定JP6的最佳培養基為在10%黃豆芽基礎上添加1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5%CaCO3。利用最佳培養基，0.2%接種量，37℃，190 r/m in，培養24 h，發酵液中JP6活菌數達到7.55×109cfu/m L，而在初始發酵培養基中活菌數為5.92×108cfu/m L，活菌數大幅度增加。

3　討論

本試驗從取自湖南官地坪煙科所煙田的煙草根際土壤中分離篩選得到JP6菌株。經形態和生理生化鑒定，以及16S rRNA測序將JP6鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。JP6菌株發酵液中的有效磷含量達到50.1mg/L，發酵液中的IAA含量達到128.9μg/m L。固體培養時，JP6菌株的溶磷比為2.6，而李明新報道的陰溝腸桿菌C-12［18］的溶磷比為2.0。C-12發酵液中有效磷含量為210.6mg/L，而JP6的發酵液中有效磷含量為50.1mg/L，這是由接種量不同導致的，試驗中C-12進行液體培養時接種量為4%，JP6進行液體培養時接種量為1%。與李曉舉［17］、李明新［18］報道的陰溝腸桿菌相比，JP6還兼有產生長素功能。在土壤模擬試驗中發現土壤中有效磷含量在前期出現降低的現象，可能原因是土壤進行自然風干處理，未進行徹底滅菌，當土壤的水分、培養溫度適宜時土壤微生物的休眠體（如芽孢）萌發，而休眠體萌發過程需要消耗土壤中的磷素，用于合成細胞結構，前期出現下降。隨著試驗時間的延長，CK組的土壤有效磷含量出現增加的現象，可能是因為土壤中存在的具有溶磷作用的微生物如芽孢桿菌會發揮溶磷功能［24］，能夠降解土壤中的難溶磷，引起土壤中有效磷含量的增加。JP6組的土壤有效磷含量在整個試驗過程中與CK組變化趨勢一致，但前60 d有效磷含量低于CK組，可能原因是接種JP6菌劑后，土壤中微生物的含量短時間內大量增加，微生物為維持生命活動消耗大量可溶性磷素，因此JP6土壤中有效磷含量比CK減少幅度大。在80 d后JP6組的土壤有效磷含量高于對照，推測原因是JP6具有溶磷功能，接種JP6后，經過一段時間適應土壤環境，開始加速土壤中難溶磷的分解。在120 d時，JP6組的有效磷含量與CK在0.05水平達到顯著差異，增加9.84%。

4　結論

本試驗篩選出兼有溶磷和產生長素功能的陰溝腸桿菌JP6菌株，通過模擬試驗驗證JP6在土壤中具有較好的溶磷作用，試驗中運用單因子試驗和正交試驗兩種方法對JP6的液體搖瓶發酵培養基進行優化。優化后的最佳培養基是在10%黃豆芽基礎上添加1.5%葡萄糖，2%豆粕，0.5%NH4Cl，0.5% CaCO3。利用稀釋涂布平板法計數，發現優化后的培養基能有效促進陰溝腸桿菌JP6菌株的生長，為陰溝腸桿菌JP6菌株下一步的實驗室培養、工業化生產以及農業生產應用提供理論依據。

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Isolation and Identification of Tobacco Rhizosphere Phosphate Solubilizing Bacteria and Optimization of Medium

LIU Hu1，HOU Zhen1，YIJian-hua2*，ZHOU Dong-bo2，ZHOU Shu-guang2，LIU Kai1，WANGCheng-qiang1，DINGYan-qin1，DU Bing-hai1*
1.CollegeofLifeSciences/Shandong AgriculturalUniversity；Shandong Key LaboratoryofAgriculturalMicrobiology，Taian271018，China
2.Research&DevelopmentCenterofChinaTobaccoHunan IndustrialCo.Ltd，Changsha410007，China

The phosphate-solubilizing bacterium was isolated w ith selectivemedium in this test.The strain was identified by 16S rRNA sequence analysis and biological characteristics including phosphate solubilization and IAA secretion.The capability of phosphate-solubilization and the production of IAA were detected by themethod of Mo-Sb colorimetry and Salkowski colorimetry.The effect of JP6 on available phosphorus in soil was verified by simulated experiments.The one factor test and the orthogonal testwere used for the optimization of a liquid culturemedium for Enterobacter cloacae JP6. The results showed that JP6 possessed the capacity of phosphate solubilization.The available phosphoruswas dissolved by JP6 as high as 50.1 mg/L in liquid culturemedium.IAA was secreted by JP6 as high as 128.9μg/m L in the R2A medium. With the culturalandmorphological characteristics，combined with 16s rRNA sequence analysis，the strain JP6was identified as Enterobacter cloacae.When the culturemedium containing 10%soybean sprouts，1.5%glucose，2%soybeanmeal，0.5% NH4Cl，and 0.5%CaCO3，the grow th of Enterobacter cloacae could increase significantly.It has a good role in dissolving phosphorus.Theoptimized culturemedium could promote thegrow th of JP6 effectively.

Phosphate-solubilizing bacteria；Enterobacter cloacae；isolation；identification；optimization ofmedium

S154.39

A

1000-2324（2016）04-0514-06

2016-04-19

2016-06-16

湖南中煙工業有限責任公司科技項目（2011-yc-0002）；山東省重大科技專項（2015ZDXX0502B02）

劉虎（1990-），男，山東臨沂人，在讀碩士研究生，研究方向：環境微生物學.E-mail：liuhu20090905@163.com

Author for correspondence.E-mail：yijh0516@hngytobacco.com；du_binghai@163.com