煙草三類根腐類病害病原真菌多重PCR檢測方法的建立

陸星星，劉偉陽，徐后娟*

1.玉溪農業職業技術學院，云南玉溪6531002.山東農業大學植物保護學院，山東泰安271018

煙草三類根腐類病害病原真菌多重PCR檢測方法的建立

陸星星1，劉偉陽2，徐后娟2*

1.玉溪農業職業技術學院，云南玉溪653100
2.山東農業大學植物保護學院，山東泰安271018

本文分別設計和驗證了煙草黑脛病菌和根黑腐病菌的特異性檢測引物，結合鐮刀菌屬通用引物，進行了煙草三類根腐類病致病菌-煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和鐮刀菌的多重PCR檢測，并對影響多重PCR的退火溫度、引物用量、dNTP用量、模板用量分別進行了分析。結果顯示，退火溫度在43～61℃范圍內，煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和鐮刀菌的引物用量在0.2：0.32～0.48：0.2μmol·L-1，dNTP用量在0.1～0.2mmol·L-1μL/25μL反應體系中，可以經濟且高效的實現對煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和鐮刀菌的特異性同步檢測。

煙草；根腐類病害；多重PCR；同步檢測

煙草是一種重要的經濟作物，田間易受到多種病蟲害的威脅，其中根腐類病害危害較為嚴重，成為制約其優質適產的重要因子［1］。引起煙草根部腐爛的病原種類較多，其中寄生疫霉煙草致病變種（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、鐮刀菌（Fusarium spp.）和基生根串珠霉（Thielaviopsis basicola）為三類重要的煙草根腐類真菌病原，三者均能危害包括烤煙、晾煙、曬煙、香料煙、白肋煙等所有栽培煙草，可在煙草的任何生育階段侵染為害，以大田期為主，導致煙葉產量和質量下降，煙農經濟利益受損［2-4］。

盡管三種病原引起的病害種類不同，寄生疫霉菌危害煙草形成黑脛病（Tobacco black shank），鐮刀菌類危害病害統稱為根腐病（Tobacco root rot），而串珠霉菌危害引起根黑腐病（Tobacco black root rot），但三種病害癥狀具有相似性，且在田間容易混合發生，導致生產中難以對病害做出及時而錯過最佳防治時期，或由于誤診而盲目用藥，其結果是不僅無法有效控制病害的發生蔓延，而且導致煙葉化學農藥殘留嚴重，環境污染和生產成本的上升。因此研究一種快速、準確、簡便的病害檢測技術日益提上日程，成為煙草病害防治過程中亟待解決的問題。本試驗旨在利用多重PCR進行同步檢測三種病原菌，并對影響因素進行優化，建立一種煙草根腐類病害的準確、靈敏的檢測方法。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試菌株煙草黑脛病菌（P.parasitica）菌株pp-sdyn12和根黑腐病菌（T.basicola）菌株tb-sdys3由山東農業大學煙草實驗室提供；根腐病菌茄病鐮刀菌（F.solani）菌株fsyx1、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）foyx5、厚孢鐮刀菌（F.chlamydosporium）菌株fcyx4由玉溪農業職業技術學院提供。引物特異性篩選對照菌株包括四種煙草根莖部病害致病菌，分別為煙草炭疽病菌（煙草炭疽菌，Colletotrichum micotianae）、煙草猝倒病菌（瓜果腐霉，Pythium aphanidormatum）、煙草低頭黑病菌（辣椒刺盤孢煙草變型，Colletotrichum capsicif.nicotianae）和煙草立枯病菌（立枯絲核菌，Rhizoctonia solani），由山東農業大學煙草實驗室提供。煙草根腐類病害材料分別采集于山東沂水和云南玉溪。

1.2煙草三類根腐類病原檢測引物的設計

利用Primer Prem ier 6.0分別設計特異性檢測引物ppf1/ppr1和tbf1/tbr1，鐮刀菌通用引物Ff1/Fr1參照Muraosa etal［5］。引物序列如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1　PCR引物Table1 Primersused in PCR

1.3基因組DNA的提取方法

將各供試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，25℃培養5～7 d，收集菌絲進行基因組DNA（gDNA）的提取；田間采集煙草根莖部病害病株材料，帶回實驗室內，洗凈表明浮土，取病健交界部位進行基因組DNA的提取。

供試菌株及病株材料DNA的提取均采用Omega公司的FungalDNAM idiKit。

如果白菜上有很大的斑點，而且清洗不掉，最好就不要食用了，這些斑點都是白菜在生長或者儲藏過程中，產生的有害物，對人身體害處很大。

1.4引物的特異性檢測

分別對煙草黑脛病菌的檢測引物ppf1/ppr1和煙草根黑腐病菌的檢測引物tbf1/tbr1的特異性進行了檢測，對照為不同真菌的gDNA，其中三種鐮刀菌的基因組DNA等量混合，組成鐮刀菌混合DNA。PCR擴增條件為：94℃5m in；94℃30 s，53℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃10m in。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗擴增結果。

1.5多重PCR體系的優化

PCR擴增體系采用25μL，包括模板（三種供試病原菌genom ic DNA，各100 ng），引物（ppf1/ppr1、tbf1/tbr和Ff1/Fr1，10μmol·L-1，各1μL），dNTPM ixture（各2.5mM，2μL），10×擴增緩沖液（Mg2+plus）2.5μL，Taq DNA聚合酶（（5 U/μL，0.5μL）），雙蒸水補齊到25μL。PCR擴增條件為：94℃4min；94℃30 s，53℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃10min。

1.5.1退火溫度對多重PCR擴增效率的影響PCR擴增體系同1.5，對PCR擴增條件中的退火溫度進行梯度設置，梯度范圍為41～63℃，梯度差為2℃，研究不同退火溫度對多重PCR擴增效率的影響。

1.5.2引物用量和配比對多重PCR擴增效率的影響PCR擴增體系設置引物用量為變量，其它成分加樣量和擴增條件同1.5，三對引物（初始濃度為10μmol·L-1）用量如表2所示。

表2　引物用量Table 2 The final concentration of different primers in the PCRm ixture

1.5.3dNTPM ixture用量對多重PCR擴增效率的影響PCR擴增體系設置dNTPM ixture為變量，其它成分加樣量和擴增條件同1.5；在25μLPCR反應體系中分別加入0.25、0.5、1、2、4和8μL的dNTP M ixture，使其終濃度分別為25、50、100、200、400和800μmol·L-1，研究不同的dNTPM ixture用量對多重PCR擴增效率的影響，篩選出經濟高效的dNTPM ixture用量。

利用1.5建立的煙草三種根腐類病害同步檢測體系，對田間采集的煙草根腐類病害標本進行了檢測。對照為健康煙草植株，單獨接種了三種不同病原的發病植株以及混合接種的發病煙草植株。PCR擴增體系采用25μL，包括模板，引物（ppf1/ppr1：tbf1/tbr：Ff1/Fr1=0.5μL：0.8μL：0.5μL），dNTP M ixture（各2.5mmol·L-1，1μL），10×擴增緩沖液（Mg2+plus）2.5μL，Taq DNA聚合酶（（5 U/μL，0.5μL）），雙蒸水補齊到25μL。PCR擴增條件為：94℃4min；94℃30 s，53℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃10m in。

2　結果與分析

2.1引物的特異性檢測

以供試菌株的genom ic DNA為模板，分別對煙草黑脛病菌的檢測引物ppf1/ppr1和煙草根黑腐病菌的檢測引物tbf1/tbr1的特異性進行了檢測，結果如圖1所示。由圖1可以看出，以ppf1/ppr1為引物、不同菌株的gDNA為模板時，只有煙草黑脛病菌能夠擴增得到576 bp的條帶，而以tbf1/tbr1為引物時，只有煙草根黑腐病菌能夠擴增得到427 bp的條帶，說明引物特異性好，可以用于對煙草黑脛病菌和根黑腐病菌兩種菌的特異性檢測。

圖1　煙草黑脛病菌和煙草根黑腐病菌引物特異性的檢測Fig.1Assessmentof the specificity of primers for P.parasitica and T.basicola

2.2退火溫度對多重PCR擴增效率的影響

由于三對（6個）引物在同一反應體系中進行，且各自的解鏈溫度不同，因此每對引物所需的最適退火溫度也存在著差異，將退火溫度設置在41℃到63℃范圍內，每隔2℃為一個處理，研究了不同退火溫度對多重PCR的影響，結果如圖2所示。由圖2可以看出，退火溫度從43℃到61℃范圍內均可以擴增得到三條條帶，而41℃和63℃的退火溫度時已經無法擴增得到鐮刀菌的目的條帶；51℃～55℃為多重PCR的最佳退火溫度，在這個范圍內，煙草黑脛病菌、煙草根黑腐病菌和鐮刀菌類煙草根腐病菌的非特異性目的條帶最為清晰。

圖2　不同的退火溫度對多重PCR的影響Fig.2 Effect of different annealing tem perature onmultip lex PCR

2.3引物用量對多重PCR擴增效率的影響

引物的用量和配比也會影響多重PCR的擴增效率。首先研究了等引物用量時多重PCR的擴增效率，由圖3的1，2和3可以看出，隨著三對引物用量從0.2μmol·L-1增加到0.6μmol·L-1，均可實現對三種煙草根腐類真菌的特異性擴增，但擴增效率存在差異，煙草黑脛病菌目的條帶最亮，鐮刀菌次之，根黑腐病菌條帶最弱。控制煙草黑脛病菌和鐮刀菌的引物用量為0.2μmol·L-1，根黑腐病菌引物用量從0.32μmol·L-1增加到1μmol·L-1，結果如圖3的4～8所示。由圖可以看出，隨著根黑腐病菌引物用量的增加，其目的條帶亮度增大，但當根黑腐病菌引物用量增加到0.6～1μmol·L-1時，煙草黑脛病菌目的條帶變弱。因此，最佳的三對引物用量為黑脛病菌：根黑腐病菌：鐮刀菌=0.2 μmol·L-1：0.32～0.48μmol·L-1：0.2μmol·L-1。

2.4dNTP用量對多重PCR擴增效率的影響

研究了dNTP用量對多重PCR擴增效率的影響，結果如圖4所示，由圖4可以看出，當dNTP用量為0.25μL，在反應體系（25μL）中終濃度為0.025mmol·L-1時，三個條帶均擴增不成功；dNTP用量提高到0.5μL，終濃度為0.05mmol·L-1時，擴增效率大大提高，表現為三個條帶均能成功擴增，但是條帶較為微弱。隨著dNTP用量的增加，擴增效率進一步提高，表現為圖4中3，4。但當dNTP用量提高到4μL（圖中5）和8μL（圖中6），終濃度分別為0.4mmol·L-1和0.8mmol·L-1時，三個特異性條帶均能成功擴增，但亮度和dNTP用量為2μL（圖中4）并沒有明顯差異。因此，25μL反應體系中經濟高效的dNTP用量范圍為1～2μL，終濃度為0.1～0.2mmol·L-1。

圖3　不同的引物用量對多重PCR的影響Fig.3 Effectof different addition levelof primersonmultiplex PCR

圖4　dNTP用量對多重PCR的影響Fig.4 Effect of different addition level of dNTPonmultip lex PCR

2.5煙草三種根腐類病害的多重PCR同步檢測體系的實際應用

利用篩選得到的煙草黑脛病菌和根黑腐病菌特異性檢測引物，結合已報道的鐮刀菌類通用引物，構建和優化了三種煙草根腐類病害的同步檢測體系，并利用該體系進行了人工接種發病煙草植株和田間病害采集標本的檢測，結果如圖5和表3所示。由圖5可以看出，建立的多重PCR體系不僅可以對接種后的感病煙草成功診斷，而且對田間采集的發病煙草也能實現正確的鑒別，因此可以用于田間煙草根莖部病害的診斷。運用此體系分別對采集于云南玉溪和山東沂水的發病煙草進行了擴增，在玉溪43株發病煙草中，黑脛病、根黑腐病和鐮刀菌類根腐病分別為13，19和9株，黑脛病和鐮刀菌類根腐病混合發生2株，根黑腐病和鐮刀菌類根腐病混合發生1株；同樣在檢測的山東沂水發病煙草標本中，也為三種病害單獨侵染，復合侵染的有1株，為根黑腐病菌和鐮刀菌混合侵染。

圖5　多重PCR檢測田間煙草根腐類病害Fig.5Detection of root-infected tobacco bymultip lex PCR

表3　多重PCR檢測采集的根腐類病害標本（株）Table 3 The detection result of infected tobacco bymultip lex PCRmethod

3　討論與結論

多重PCR同步檢測已經在多種病害（病原）上有報道，如岳紅妮等［6］對小麥三種病毒病-大麥條紋花葉病毒、大麥黃矮病毒PAV株系、小麥黃花葉病毒及小麥藍矮植原體病害進行了同步檢測，孫娟等［7］同步檢測棉黃萎病菌、枯萎病菌和炭疽病菌，許拉等［8］對兩種對蝦病毒和4種弧菌進行了同步檢測，但對于鐮刀菌引起的根腐病、疫霉菌引起的黑脛病和串珠霉引起的根黑腐病目前沒有同步檢測的報道。由于我國煙區這三種根腐類病害發生危害十分嚴重，且三種病害的癥狀具有相似性，生產上難以做到準確判斷，因此建立一個三種煙草根腐類病害的同步檢測體系具有非常重要的實際意義。

多重PCR同步檢測多種病原具有快速、節約、簡便、高通量等優點［9，10］，但由于在同一反應體系中使用多對引物對多個模板進行擴增，要求各個引物之間具有相似的Tm值，可以使用同一個退火溫度，同時也要避免各個引物對之間的相互干擾。而且由于引物和模板的不同，不同病原菌之間的最適多重PCR體系各有差異，因此需要針對不同的病原菌，從影響多重PCR的主要因素出發，逐步分析各影響因素并優化，以建立一個適合特定病原菌的最佳多重PCR檢測體系。在本項目中，我們分別對影響最大的退火溫度、引物用量和配比、dNTP用量進行了分析，建立了一個可同步檢測煙草黑脛病菌、根黑腐病菌和鐮刀菌的同步檢測體系，并進行了實際利用，為煙草生產上根腐類病害的診斷提供了技術支持。

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Establishment and Application of Multiplex PCR Method for Detection of Three Root Rotting Fungi on Tobacco

LU Xing-xing1，LIUWei-yang2，XU Hou-juan2*
1.YuxiAgriculture Vocation-technicalCollege，Yu xi653100，China
2.College ofPlantProtection/Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China

Specific primers for Phytophthora parasitica var.nicotianae and Thielaviopsis basicola were designed and verified.Based on these results and reported specific primer for Fusarium spp.，a detection system usingmultiplex PCR was developed and optimized.Annealing temperature，the concentrations of primers and dNTPs were examined.An economic and efficientprotocolwere established and applied to detect the infected tobacco.In this protocol，annealing temperaturewas 43 to 61℃，primers for Phytophthora parasitica var.nicotianae，Thielaviopsis basicola and Fusarium spp.were 0.2：0.32-0.48：0.2μmol·L-1，respectively and dNTPwas0.1 to 0.2mmol·L-1.

Tobacco；root rotdiseases；multiplex PCR；simultaneous detection

S431.9

A

1000-2324（2016）04-0520-05

2016-03-14

2016-04-11

中國煙草總公司山東省公司面上項目：煙草細菌性葉斑病快速鑒定技術研究與應用

陸星星（1976-），女，碩士，研究方向為煙草栽培及生理.E-mail：yxnzyxcb@163.com

Author for correspondence.E-mail：xhjuan@sdau.edu.cn