梔子金花丸HPLC指紋圖譜及其與體外抗氧化活性的相關性分析

陳　帥，王慧竹，薛健飛，鐘方麗#，李玲麗

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林　132022；2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽　110016）

梔子金花丸HPLC指紋圖譜及其與體外抗氧化活性的相關性分析

陳帥1，2＊，王慧竹1，薛健飛1，鐘方麗1#，李玲麗1

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.沈陽藥科大學藥學院，沈陽110016）

目的：建立梔子金花丸指紋圖譜，并分析與其體外抗氧化活性之間的相關性，為梔子金花丸的質量控制提供依據。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜柱為Sinochrom ODS-BP C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.2%磷酸溶液（含3 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液）-乙腈（梯度洗脫），檢測波長為254 nm，流速為0.8 ml/min，柱溫為38℃，進樣量為10μl。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件”（2012.130723版）對12批梔子金花丸液相圖譜進行相似度評價，以黃芩苷為參照峰，對各指紋共有峰進行歸屬。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除試驗考察12批梔子金花丸的體外抗氧化活性，并對其指紋圖譜與體外抗氧化活性之間的譜-效關系進行研究。結果：建立了梔子金花丸指紋圖譜，12批次梔子金花丸指紋圖譜與對照圖譜相似度均在0.9以上（S1、S2、S3、S12除外）；標記了30個共有峰，并全部歸屬到各成方藥材中；體外抗氧化試驗結果顯示，不同批次梔子金花丸抗氧化能力存在差異；譜-效關系結果顯示，13個共有峰與抗氧化活性呈正相關，17個共有峰呈負相關，在已知成分中發揮抗氧化活性的成分主要集中在金銀花、黃芩和大黃3味藥材中。結論：所建立的指紋圖譜及其與抗氧化活性的譜-效關系可為該藥的質量控制提供參考。

梔子金花丸；指紋圖譜；高效液相色譜法；抗氧化

梔子金花丸始載于《宣明論方》，是由梔子、黃芩、黃連等8味藥組成的中藥制劑，具有涼血解毒、清熱瀉火等功效，常用于治療口舌生瘡、牙齦腫痛、咽喉腫痛等癥［1］。目前梔子金花丸標準中除去對各味藥材的定性鑒別外，在含量測定項下僅以梔子苷的含量作為梔子金花丸的定量測定指標，對其他成方藥材的質量未作要求。梔子金花丸中主要含有梔子苷［2］、黃芩苷［3］、番瀉苷A、番瀉苷B［4］、芒果苷［5］、小檗堿、大黃素、大黃酚［6］等活性成分。目前關于梔子金花丸的質量控制研究主要集中在多指標定量和薄層色譜鑒別方面［7-8］，但這些研究均無法體現梔子金花丸發揮藥效的物質基礎及化學成分的整體性，不能使其質量得到全面的控制。

指紋圖譜技術因其在評價中藥質量時具有整體性和模糊性的特點，被廣泛用于中藥材及其中藥制劑的質量控制；而且，隨著檢測要求的不斷提高，通過建立指紋圖譜可以比較全面地掌握藥品信息，將其納入質量標準已成現行趨勢［9］。中藥藥效的發揮有賴于多個成分的協同作用，指紋圖譜雖能標示中藥中的多種成分，但這些化學成分的標示與中藥藥效的發揮可能不完全一致，因此僅僅研究中藥的化學指紋圖譜遠遠不夠。只有將中藥的化學指紋圖譜與中藥的藥效緊密結合起來，建立具有實際意義的譜-效關系，才能為中藥質量控制提供更科學的依據［10］。為了更好地控制梔子金花丸的質量，保證其藥效，筆者選擇其抗氧化活性為藥效指標，對3個企業生產的12批梔子金花丸的指紋圖譜與抗氧化活性關系進行初步研究，為科學評價其質量提供依據。

1　材料

1.1儀器

1260型高效液相色譜儀（包括四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站）購自美國Agilent公司；AUY220型分析天平（日本島津精密儀器分析公司）。

1.2藥品、對照品與試劑

12批梔子金花丸（規格均為6 g/袋）具體來源見表1。梔子苷對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品、大黃素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-15022411、MUST-13112909、MUST-14052312、MUST-14062204、MUST-13053012、MUST-20140107，純度：均≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［DPPH，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，批號：2175918，純度：＞97%］；乙腈（色譜純，天津市永大化學試劑有限公司，批號：20130617）；維生素C（VC）原料藥（天津市北辰方正化學試劑廠，批號：20150402，純度：99%）；其余試劑均為分析純。

表1　不同批次梔子金花丸樣品編號及生產廠家Tab 1　The numbers of different batches of ZZJHW and their manufacturers

1.3藥材

梔子（批號：20150421）、黃芩（批號：20141016）、大黃（批號：20150608）、黃連（批號：20150805）、黃柏（批號：20141101）、金銀花（批號：20150616）、知母（批號：20141015）、天花粉（批號：20140903）均由吉林市吉林大藥房提供，經吉林化工學院鐘方麗教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）標準。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為Sinochrom ODS-BP C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.2%磷酸溶液（含3 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液），流動相B為乙腈（梯度洗脫程序：0～8 min，5%～12%B；8～20 min，12%～20%B；20～29 min，20%～23%B；29～35 min，23%～29%B；35～40 min，29%～32%B；40～46 min，32%～32%B；46～50 min，32%～49%B；50～58 min，49%～ 50%B；58～62 min，50%～60%B；62～65 min，60%～87%B；65～70 min，87%～90%B；70～75 min，90%B）；流速為0.8 ml/min；檢測波長為254 nm；柱溫為38℃；進樣量為10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液精密稱取梔子苷對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品、黃芩素對照品、漢黃芩素對照品、大黃素對照品適量，加流動相溶解，制成梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃素質量濃度分別為328、270、74.8、214、95.8、41.4 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取梔子金花丸粉末約6.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入75%甲醇60 ml，回流提取2次，第1次1 h、第2次40 min；濾渣再用75%乙醇提取1次，時間為30 min；合并3次濾液，減壓回收溶劑，置于100 ml量瓶中，流動相稀釋并定容，搖勻，4℃條件避光保存。進樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3缺味陰性對照溶液按2015版《中國藥典》（一部）［1］中規定的梔子金花丸處方比例，分別配制不含梔子、黃芩、大黃、黃連、黃柏、金銀花、知母、天花粉以及不含黃連和黃柏2味藥材的缺味陰性樣品處方，并按梔子金花丸成方工藝制備，分別按“2.2.2”項下方法處理，即得各缺味陰性對照溶液。

2.2.4單味藥材溶液按2015年版《中國藥典》（一部）［1］中規定的梔子金花丸處方比例，以6.0 g為處方總量，計算各單味藥材的質量，分別按“2.2.2”項下方法處理，即得各單味藥材溶液。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性實驗精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。通過比較保留時間和在線紫外光譜，確定供試品溶液的色譜圖中6、15、19、22、25、28號峰分別為梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃素峰。其中因15號（黃芩苷）色譜峰比較穩定且信號強，故選其為參照峰。在此系統中15號峰理論板數不低于60 000，其余各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，表明該條件下方法專屬性良好。

2.3.2精密度試驗取同一份供試品溶液（按“2.2.2”項下方法制備的S4供試品溶液），按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，以黃芩苷峰為參照。結果，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%，相對峰面積RSD均小于2.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩定性試驗取S4供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、6、8、12、24 h進樣，以黃芩苷峰為參照。結果各共有峰相對保留時間RSD均小于1.8%，相對峰面積RSD均小于2.1%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.4重復性試驗取S4供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以黃芩苷峰為參照。結果，各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.2%，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.4指紋圖譜的研究

2.4.1指紋圖譜的建立取12批梔子金花丸樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄75 min內的色譜圖，以色譜峰出現率100%記錄共有峰。結果顯示，30個色譜峰為各樣品所共有，共有峰的總面積占總峰面積的85%以上，以混合對照品（梔子苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、大黃素）進行峰定位，色譜圖見圖1。

2.4.2指紋圖譜分析將經過積分處理的樣品色譜圖“AIA文件”導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件（2012.130723版），以樣品S4的圖譜為參照圖譜，設定時間窗為0.3 min，采用中位數法，按Mark峰進行自動匹配，生成對照指紋圖譜。指紋圖譜詳見圖2，相似度評價結果見表2。

圖1　梔子金花丸S4樣品和混合對照品的HPLC圖譜Fig 1　HPLC chromatograms of ZZJHW sample of S4 and mixed control

圖212　批梔子金花丸的HPLC指紋圖譜及對照圖譜Fig 2　HPLC fingerprint chromatogram and reference fingerprint of 12batches of ZZJHW

表2　12批梔子金花丸相似度結果Tab 2　The similarity results of 12batches of ZZJHW

由表2可見，12批樣品中除S1、S2、S3、S12外，其余批次樣品與對照指紋圖譜間相似度均在0.9以上。這表明梔子金花丸成方制劑不同批次間相似度較好、質量比較穩定。

2.5色譜峰的歸屬

取“2.2.3”項下得到的各缺味陰性溶液及單味藥材溶液10 μl，按“2.1”項下條件進樣，記錄色譜圖，見圖3。對比各吸收峰的保留時間及在線紫外光譜圖，可以得到梔子金花丸圖譜中的25個特征峰在8味藥材中的歸屬，其中1號色譜峰為金銀花提供，2、3、4、16號色譜峰為梔子提供，7、18號色譜峰為知母提供，9、11、14、15、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27號色譜峰為黃芩提供，13號色譜峰為黃連提供，10、12、23、28、29、30號色譜峰為大黃提供，5號色譜峰為梔子和知母共同提供。因此在本試驗確定的色譜條件下得到的梔子金花丸指紋圖譜能夠基本反映制劑中的主要化學成分。

圖3　各單味藥材及缺味陰性溶液色譜圖Fig 3　Chromatogram of single herb and negative solution

2.6體外抗氧化試驗[11-12]

2.6.1DPPH溶液的制備取DPPH 10.0 mg，精密稱定，置于25 ml棕色量瓶中，加無水乙醇適量，超聲使其完全溶解，定容，作為貯備液。精密吸取上述貯備液6.0 ml，置于50 ml棕色量瓶中，無水乙醇定容，搖勻，即得。

2.6.2DPPH自由基清除率的測定精密量取按“2.2.2”項下方法制備的12批供試品溶液各2.0 ml，置于25 ml量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。精密吸取上述溶液0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 ml，分別置于10 ml棕色量瓶中，再分別加入4.0 ml DDPH溶液，無水乙醇定容，搖勻，避光放置40 min。在517 nm波長下測定吸光度Ai（供試品溶液+DPPH溶液），同法測得Aj（供試品溶液+無水乙醇溶液）和Ac（無水乙醇溶液+DPPH溶液）。以相同質量濃度的VC作為陽性對照。計算DPPH自由基清除率：清除率（%）=［1-（Ai-Aj）］/Ac×100%。以藥物質量濃度為橫坐標、清除率為縱坐標進行對數回歸，根據回歸方程計算半數抑制濃度（IC50）。不同批次梔子金花丸及VC抗氧化能力結果見圖4。

圖4　不同批次梔子金花丸及VC抗氧化能力比較Fig 4　Comparison of antioxidant ability between different batches of ZZJHW and VC

由圖4可見，不同批次梔子金花丸的體外抗氧化能力有明顯差別，其中樣品S7的IC50最大，表明其抗氧化能力最弱；樣品S8的IC50最小，表明其抗氧化能力最強，但弱于VC。

2.7指紋圖譜與抗氧化活性譜-效關系分析

為了研究梔子金花丸指紋圖譜中各共有峰對抗氧化活性的貢獻大小，以12批次梔子金花丸各共有峰的峰面積作為X矩陣，以各批藥材的IC50作為Y變量，利用SIMCA 13.5進行偏相關分析，并建立IC50預測值與實際值之間的回歸模型，結果見圖5。

圖5　各共有峰與IC50之間的相關性Fig 5　The correlation between common peak and antioxidant activity IC50

由圖5可知，指紋圖譜中30個共有峰對藥物體外抗氧化活性貢獻程度存在差異，其中有13個共有峰與抗氧化活性呈正相關，1、25、28號峰與IC50正相關性比較大。但由于試驗條件原因，未能對1號峰定性，即在已知成分中與IC50正相關關系比較大的為漢黃芩素和大黃素。在17個共有峰與抗氧化活性呈負相關的色譜峰中，3、16號峰與IC50相關性比較大，但由于試驗條件原因，未能對3、16號色譜峰定性。

通過建立IC50預測值與實際值之間的關系，驗證偏相關分析所建模型的合理性，見圖6。

圖6　抗氧化活性IC50預測值與實際值之間的關系Fig 6　The relationship between the predicted value and the actual value of antioxidant activity IC50

從圖6可以看出，12批梔子金花丸均勻地分布于回歸線兩側，表明12批梔子金花丸抗氧化活性的實際值與預測值間呈良好的線性關系（r=0.981 5），同時驗證了譜-效關系分析過程中所建立的偏相關模型的合理性。

3　討論

中藥制劑多為復方制劑，化學組成比較復雜，為盡可能在同一張色譜圖上顯示更多的信息，本試驗在供試品溶液制備過程中對多種提取方法進行了考察和優化，并分別對提取溶劑（甲醇、乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流）及提取時間進行了考察。最終選用75%甲醇回流提取2次，第1次1 h、第2次40 min；濾渣再用75%乙醇回流提取1次，時間為30 min。結果表明，經此方法制備的供試品溶液不僅色譜峰強度較好而且數量較多，并且試驗過程操作簡便。

在流動相的選擇上，筆者分別考察了用0.1%磷酸溶液-甲醇、0.2%磷酸溶液-乙腈、0.2%磷酸溶液（含3 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液）-乙腈等作為流動相進行梯度洗脫。結果顯示，當采用0.2%磷酸溶液（含3 mmol/L庚烷磺酸鈉溶液）-乙腈洗脫時，得到的色譜峰峰形和分離度較好、基線較平，故在本試驗中以其為流動相。在檢測波長的選擇上，筆者分別在220、230、240、254、278、300、326 nm 7個波長下分別記錄并比較HPLC圖，結果在254 nm波長下檢測到的色譜峰數量較多、強度適中，并且基線平穩，所以選定254 nm作為梔子金花丸指紋圖譜測定的檢測波長。除此之外，筆者還分別對柱溫、流速、進樣量進行了優化，通過比較色譜圖，最終確定柱溫為38℃、流速為0.8 ml/min、進樣量為10 μl。在缺味陰性溶液的制備過程中，由于黃連和黃柏均含有小檗堿，為了對其進行定性分析，除了制備正常的缺味陰性溶液外，還制備了同時缺黃連和黃柏的陰性溶液。

通過對不同批次的梔子金花丸的色譜圖比較分析，確定了30個共有峰，并以黃芩苷峰作為參照計算了各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并進行了方法學研究，利用國家藥典委員會的指紋圖譜相似度評價軟件對12批樣品色譜圖進行了相似度評價。通過研究指紋圖譜與各批次藥品抗氧化活性之間的譜-效關系，首次聯合評價了指紋圖譜共有模式中的30個共有峰與活性的關系。結果顯示，梔子金花丸中抗氧化活性的成分主要集中在金銀花、黃芩和大黃3味藥材中，而梔子、知母中含有的一些化學成分與梔子金花丸的抗氧化活性呈負相關。但本研究未對指紋圖譜共有模式中與抗氧化活性相關性較大的化學成分進行定性及定量，缺少對活性成分與藥效之間的量-效關系研究，這也將成為筆者今后研究工作的重點。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：1 165.

［2］嚴安定，張永，高建.RP-HPLC法同時測定不同品種梔子及梔子金花丸中梔子苷［J］.中成藥，2012，34（5）：965.

［3］林輝.HPLC法測定梔子金花丸中黃芩苷的含量［J］.海峽藥學，2012，24（11）：79.

［4］高曉燕，盧建秋.梔子金花丸中梔子苷、黃芩苷、番瀉苷A和番瀉苷B的含量測定方法研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（20）：2 649.

［5］溫金蓮，周清，宋粉云.RP-HPLC測定梔子金花丸中芒果苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（17）：65.

［6］蔣范任，蔡洪鯤，周翀，等.反相高效液相色譜法同時測定梔子金花丸中梔子苷、小檗堿、黃芩苷、大黃酸、大黃素、大黃酚的含量［J］.中南藥學，2015，13（2）：172.

［7］陳曉虎，蘇晶，王慧，等.UPLC法同時測定梔子金花丸中11種成分［J］.中草藥，2014，45（6）：955.

［8］李正國，孫兆偉，劉琳琳.梔子金花丸中黃連、黃柏薄層鑒別方法研究［J］.中國藥事，2010，24（11）：1 122.

［9］孫國祥，胡玥珊，智雪枝.用復雜性科學原理揭示中藥指紋圖譜的本質特征［J］.中南藥學，2008，6（5）：600.

［10］羅志江，徐彥，吳建英，等.虎杖指紋圖譜及其抗氧化活性的“譜-效”關系研究［J］.西南大學學報：自然科學版，2012，34（1）：138.

［11］曹玉娜，宋志前，魏征，等.抗氧化劑的抗氧化活性測定方法研究進展［J］.中國藥房，2013，24（1）：86.

［12］陳帥，王慧竹，鐘方麗，等.葫蘆巴總黃酮提取工藝及其體外抗氧化活性［J］.青島科技大學學報：自然科學版，2015，36（6）：628.

（編輯：林靜）

Analysis of the Relationship of HPLC Fingerprint of Zhizi Jinhua Pills with Its in vitro Antioxidant Activity

CHEN Shuai1，2，WANG Huizhu1，XUE Jianfei1，ZHONG Fangli1，LI Lingli1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin Jilin 132022，China；2.School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To establish fingerprint of Zhizi jinhua pills（ZZJHW）and analyze the relationship of it with in vitro antioxidant activity，in order to provide the basis for the quality control of them.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on a Sinochrom ODS-BP C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）column with mobile phase consisted of 0.2%acetic acid（containing 3 mmol/L sodium heptanesulfonate solution）-acetonitrile（gradient elution）at the detection wavelength of 254 nm and flow rate of 0.8 ml/min.The column temperature was controlled at 38℃，and injection volume was 10 μl.The“Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System for TCM”（2012.130723 edition）issued by Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 12 batches of ZZJHW using baicalin as reference peak so as to attribute the common peak of fingerprint.DPPH free radical scavenging assay was used to investigate the in vitro antioxidant activity of 12 batches of ZZJHW，and the relationship between its fingerprint and antioxidant activity was studied.RESULTS：The fingerprint of 12 batches of ZZJHW was established and the similarity between the fingerprint of ZZJHW with their reference fingerprint were all above 0.9 （except S1，S2，S3，S12）.30 common peaks were marked，all of which were assigned to the herbs.Antioxidant experiment result showed the differences in the antioxidant capacity among different batches of ZZJHW；spectrum effect relationship showed that 13 common peaks were positively related with oxidation activity and 17 common peaks negatively related with it；among known components，oxidation activity components were mainly from Lonicera japonica，Scutellaria baicalensis and Rheum palmatum.CONCLUSIONS：The spectrum effect relationship of established fingerprint with its antioxidant activity can provide reference for the quality control of ZZJHW.

Zhizi jinhua pills；Fingerprint；HPLC；Antioxidation

R927.1

A

1001-0408（2016）22-3077-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.16

＊講師，碩士。研究方向：中藥制劑分析。E-mail：chenshuai2011 @163.com

教授，博士。研究方向：天然產物化學及應用。電話：0432-62183130。E-mail：fanglizhong@sina.com

2016-01-10

2016-04-14）