熒光光譜法測定3種黃酮類化合物與人血清白蛋白相互作用的機制研究Δ

蘭　蕊，龔小保，黃利掛，陳　竹，曾　雪，張保順#

（1.西南大學藥學院，重慶　400715；2.重慶醫藥高等專科學校藥學系，重慶　400030）

熒光光譜法測定3種黃酮類化合物與人血清白蛋白相互作用的機制研究Δ

蘭蕊1＊，龔小保1，黃利掛1，陳竹2，曾雪2，張保順1#

（1.西南大學藥學院，重慶400715；2.重慶醫藥高等專科學校藥學系，重慶400030）

目的：研究黃酮類化合物與人血清白蛋白（HSA）相互作用的機制，比較化合物B環不同取代基（羥基、甲氧基）對大分子物質結合的影響。方法：采用熒光光譜法對槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素3種B環取代基不同的黃酮類化合物與HSA相互作用的規律進行研究，測定并分析3種黃酮類化合物與HSA發生熒光猝滅的類型，計算相應的結合常數、結合位點及熱力學參數等。結果：隨著溫度的升高，猝滅常數（Ksv）均呈規律性下降，結合常數（KA）相應降低，結合位點數（n）近似等于1，熱力學參數ΔH＜0、ΔS＞0，B環的取代基不同對大分子物質結合有影響。結論：3種黃酮類化合物與HSA相互作用發生熒光猝滅的機制屬于靜態猝滅；結合位點數為1；3種化合物與HSA之間的作用力以靜電力為主；羥基可能為黃酮類化合物與大分子物質相互作用的主要活性基團，甲氧基與HSA的結合力小于羥基。

黃酮；熒光猝滅；人血清白蛋白；機制

人血清白蛋白（HSA）是人體血液循環中最為豐富的蛋白質，約占血漿總蛋白含量的60%，是藥物運輸的重要載體［1-2］。近年來，生物大分子與藥物之間的結合作用成為研究熱點。人體血液中每個配體與血漿蛋白結合的過程，對藥動學和藥效學均可產生一定的影響，如減輕藥物毒性、延長半衰期等。因此，研究血清白蛋白與藥物間的作用關系，探討不同基團對兩者相互作用的影響［3］，能更好地了解藥物在體內的吸收和分布。

自然界存在的黃酮類化合物具有重要藥理活性，其廣泛分布于植物的根、莖、葉和果實中［4］。目前關于黃酮或類黃酮類化合物與HSA發生熒光猝滅的機制研究，以及金屬離子對藥物與蛋白質親和力的影響有較多報道，如徐倩等［5］采用熒光法和分子對接的方法研究黃酮類相互作用機制；蘭玲等［6］利用熒光光譜法，發現大豆素和葛根素與HSA相互作用均發生熒光猝滅，且為靜態猝滅過程，葛根素與HSA結合力強于大黃素。而針對多羥基黃酮類化合物中B環上的不同基團與HSA作用后所引起熒光猝滅的差異卻少有報道。本研究通過熒光光譜法，在模擬人體pH條件下（pH 7.4），定性地研究槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素3種黃酮類化合物對HSA的熒光猝滅反應，根據3種化合物B環上3′、4′位取代基的不同，初步探究含羥基（-OH）的槲皮素、含1個甲氧基（-OCH3）的橙皮素、含2個-OCH3的甲基橙皮素與HSA相互作用的影響。通過計算判斷其猝滅類型、結合常數以及結合位點，從而更好地了解藥物與HSA分子間的相互作用機制。槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素分子結構詳見圖1。

圖1　槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素分子結構Fig 1　Molecular structure of quercetin，hesperetin and methyl hesperetin

1　材料

1.1儀器

F-4500熒光分光光度計（日本日立公司）；AL-104電子分析天平（美國梅特勒-托利多儀器有限公司）；HH-1恒溫水浴鍋（金壇市萬華實驗儀器廠）；FE28-Standard FiveEasy Plus型臺式pH計（美國梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV-3150型紫外可見分光光度計（日本Jasco公司）。

1.2藥品與試劑

HSA（同路生物制藥有限公司，批號：20130946，純度：＞99%）；槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素（均為實驗室自制，純度：＞99%）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：BT350-500G）；鹽酸（HCl，分析純，重慶川東化工有限公司）；氯化鈉（NaCl，分析純，成都市科龍化工試劑）；水為二次蒸餾水。

2　方法

2.1溶液的配制

2.1.1HSA溶液的配制量取適量HSA溶解于pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/L，含NaCl 0.1 mol/L以維持離子強度），混勻并定容，制成濃度為1.0×10-4mol/L的HSA溶液，低溫保存，備用。

2.1.2黃酮類化合物溶液的配制稱取槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素適量，分別溶解于pH為7.4的Tris-HCl緩沖液（0.1 mol/ L，含NaCl 0.1 mol/L以維持離子強度），混勻并定容，制成濃度均為1.0×10-4mol/L的槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素溶液，低溫保存，備用。

2.2熒光發射光譜的測定

吸取“2.1.1”項下HSA溶液1 ml于10 ml量瓶中，分別加入0、1、2、4、6、8 ml槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素溶液，用Tris-HCl緩沖液定容，分別于25、31、37℃下恒溫水浴30 min，以280 nm波長為激發波長，340 nm波長為發射波長，激發狹縫和發射狹縫的寬度設為5 nm，在290～500 nm波長范圍內測定樣品的熒光發射光譜。分別記錄25、31、37℃溫度下的熒光強度（F），用于判斷并比較3種黃酮類化合物與HSA發生熒光猝滅的類型，計算相應的結合常數、結合位點及熱力學參數等。

3　結果與討論

3.1槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素對HSA熒光光譜的影響

按照“2.2”項下方法分別測定25、31、37℃下槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素的熒光猝滅圖譜，結果，3個溫度下圖譜相差不大，故選擇便于操作的接近室溫的25℃為恒溫水浴溫度，之后，測定不同濃度的槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素在25℃溫度條件下對HSA的熒光猝滅光譜，結果見圖2。由圖2可知，隨著3種化合物濃度的增加，其相應的HSA熒光圖譜中的特征峰均表現出降低趨勢，說明HSA與3種化合物均發生相互作用導致規律性的熒光猝滅。其相應特征峰降低趨勢存在一定差異：隨著槲皮素濃度增大，熒光物質的熒光強度降低最顯著；橙皮素次之；甲基橙皮素與HSA發生熒光猝滅后，其熒光物質的熒光強度降低趨勢最小。由此推斷，黃酮類化合物B環上3′、4′基團的不同可影響藥物與蛋白質的結合（圖中a→f代表黃酮類化合物的濃度依次為0、1×10-5、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5mol/L）。

圖23　種黃酮類化合物與HSA的熒光猝滅圖譜A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 2　The fluorescence quenching spectra of HSA by three kinds of flavonoidsA.quercetin；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

3.2熒光猝滅類型

蛋白質等生物大分子熒光猝滅根據其機制不同可分為動態猝滅、靜態猝滅和非輻射能量轉移［7］。陳科力等［8］曾報道藥物對大分子物質HSA的熒光猝滅機制主要分為激發態反應、能量轉移、形成復合物以及碰撞導致的熒光猝滅。動態猝滅過程與擴散有關，在一定范圍內，隨著溫度升高，擴散系數隨之增大，從而使雙分子猝滅常數Kq增大；靜態猝滅則反之，溫度升高將降低化合物-大分子物質形成的復合物穩定性，從而減小猝滅的程度。動態猝滅一般遵循Stern-Volmer方程［9］。

式（1）中，F0為無猝滅劑時熒光物質的熒光強度，F為加入猝滅劑時熒光物質的熒光強度，Ksv為動態猝滅常數（稱為Stern-Volmer猝滅常數），［Q］為猝滅劑的濃度，Kq為由擴散過程控制的雙分子動態猝滅速率常數，τ0為無猝滅劑時生物大分子的平均熒光壽命（約為10-8s［10］）。

以［Q］為橫坐標，以F0/F為縱坐標進行線性回歸，可以得到Stern-Volmer曲線，斜率即為動態猝滅常數Ksv，詳見圖3。槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素的Ksv和Kq見表1。理論上，猝滅劑對大分子物質的最大碰撞猝滅常數為2.00×1010L/（mol·s）。若化合物與HSA熒光猝滅屬于動態猝滅類型，則應當符合Stern-Volmer方程，即Ksv隨著溫度升高而增大，而靜態猝滅常數則減小，可由此判斷熒光猝滅類型［11］。由圖3可知，隨著溫度的升高，Ksv值均減小，且Kq遠遠超出擴散碰撞過程中的最大碰撞猝滅常數約3個數量級，說明上述3種化合物與HSA發生熒光猝滅均不符合動態猝滅規律，可能是化合物與HSA形成新復合物而發生的靜態猝滅。

圖3　不同溫度下3種黃酮類化合物對HSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 3　Stern-Volmer curves of three kinds of flavonoids on HSAunder different temperaturesA.quercetin；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

表1　不同溫度下槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的猝滅常數Tab 1　Interaction constants of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin to HSAunder different temperatures

3.3結合常數（KA）及結合位點數（n）的測定

靜態猝滅中熒光體系的熒光強度（F）、KA、n及猝滅劑的濃度［Q］之間的關系可以用式（2）表示。

以lg（c［Q］）為橫坐標，以lg［（F0-F）/F］為縱坐標進行線性回歸，結果見圖4。不同溫度下槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素與HSA結合常數和結合位點數見表2。由表2可知，槲皮素、橙皮素和甲基橙皮素與HSA結合位點數均接近1，進一步證明了上述3種化合物對HSA的猝滅方式為靜態猝滅；隨著溫度的升高，其結合常數KA相應地降低，說明溫度對上述化合物與HSA形成的新復合物的穩定性有一定影響；同一溫度下，3種化合物與HSA的結合常數KA存在一定差異，KA由大到小依次為：槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素，說明B環上3′、4′位取代基對化合物與HSA結合有一定影響。隨著B環3′、4′位羥基數目減少、甲氧基數目增加，結合力相應減弱，說明羥基可能是與大分子物質結合的活性基團，而甲氧基與蛋白質結合力小于羥

圖4　不同溫度下3種黃酮類化合物對HSA熒光猝滅的雙對數曲線A.槲皮素；B.橙皮素；C.甲基橙皮素Fig 4　Double-log plots of three kinds of flavonoids quenching on HSAunder different temperaturesA.querceti；B.hesperetin；C.methyl hesperetin

表2　不同溫度下槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的結合常數及結合位點數Tab 2　The binding constant and binding sites of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin with HSA under different temperatures

3.43種化合物與HSA結合的作用力及熱力學參數

生物大分子與小分子之間的作用力包括范德華力、靜電力、疏水相互作用力等。當溫度變化不大時，反應焓變（ΔH）可認為是一個常數。根據反應前后的熱力學參數焓變（ΔH）和熵變（ΔS）的相對大小，可以確定分子間的相互作用力類型［12］：當ΔH＜0、ΔS＜0時，分子間作用力為氫鍵和范德華力；當ΔH＜0、ΔS＞0時，分子間作用力為靜電引力；ΔH＞0、ΔS＞0時，分子間作用力為疏水作用力［13］。熱力學公式如式（3）、式（4）。

利用式（3）分別計算出不同溫度（T）下3種化合物對HSA作用的焓變ΔH和熵變ΔS（式中K為KA，下同）。由式（4）計算吉布斯自由能ΔG，結果見表3。根據Ross PD等［14］總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律，推斷出3種化合物與HSA之間的作用力均以靜電力為主，但各自又存在一定差異，吉布斯自由能ΔG由大到小依次為甲基橙皮素＞橙皮素＞槲皮素；ΔH均小于0，說明反應是一個放熱過程。

表3　槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA作用的熱力學參數Tab 3　Thermodynamic parameters of the interaction of quercetin，hesperetin，methyl hesperetin with HSA

4　結論

通過熒光光譜試驗結果得知，槲皮素、橙皮素、甲基橙皮素與HSA的熒光猝滅類型屬于靜態猝滅，結合位點數均為1，即藥物分子與生物大分子形成1∶1的復合物；通過對3種化合物的熱力學參數計算可知，ΔG＜0，反應可自發進行，其與HSA相互作用類型以靜電力為主。3種化合物B環上3′、4′位取代基對化合物與HSA結合力有一定影響，即同一溫度下，隨濃度升高，3種化合物各自對應的熒光圖譜的特征峰降低趨勢有明顯差異：槲皮素F值降低最顯著，橙皮素次之，甲基橙皮素F值降低趨勢較小。同一溫度時對應的Ksv由大到小依次為槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素，其結合常數KA大小由大到小依次為槲皮素＞橙皮素＞甲基橙皮素；溫度一定時，吉布斯自由能ΔG由大到小依次為甲基橙皮素＞橙皮素＞槲皮素。以上均說明羥基可能是與大分子物質結合的主要基團，而甲氧基與生物大分子結合能力比羥基弱，羥基的數目影響黃酮類化學物與人血清白蛋白相互作用的結合常數和結合位點。馬康等［15］報道，3種黃酮類化合物（高良姜素、山萘酚、槲皮素）隨B環上羥基數目增加，與牛血清蛋白（BSA）結合能力增強。本試驗針對黃酮類化合物B環3′、4′位的基團不同，比較其與HSA結合的差異，進一步驗證了羥基可能是與大分子物質結合的活性基團，同時推測甲氧基與大分子物質結合的能力弱于羥基，但是關于結合力強弱的原因有待進一步探討。因此，可利用羥基比甲氧基結合能力強這一特點，為后續藥物與大分子物質結合以及藥物分子活性基團的修飾改性提供理論依據。

［1］Zhang G，Wang L，Pan J.Probing the binding of the flavonoid diosmetin to human serum albumin by multispectroscopic techniques［J］.J Agric Food Chem，2012，60 （10）：2 721.

［2］Vorum H，Honoré B.Influence of fatty acids on the binding of warfarin and phenprocoumon to human serum albumin with relation to anticoagulant therapy［J］.J Pharm Pharmacol，1996，48（8）：870.

［3］ Ding F，Diao JX，Sun Y，et al.Bioevaluation of human serum albumin-hesperidin bioconjugate：insight into protein vector function and conformation［J］.J Agric Food Chem，2012，60（29）：7 218.

［4］謝孟峽，徐曉云，王英典，等.4，5，7-三羥基二氫黃酮與人血清白蛋白相互作用的光譜學研究［J］.化學學報，2005，63（22）：2 055

［5］徐倩，鄧丹丹，曹志娟，等.熒光法和分子對接研究4種黃酮與血清白蛋白的相互作用［J］.分析化學研究報告，2010，38（4）：483.

［6］蘭玲，袁婧威，趙成新，等.異黃酮分子與人血清白蛋白的相互作用［J］.河北聯合大學學報：自然科學版，2015，37 （4）：45.

［7］Zhang J，Wang XJ，Yan YJ，et al.Comparative studies on the interaction of genistein，8-chlorogenistein，and 3′，8-dichlorogenistein with bovine serum albumin［J］.J Agric Food Chem，2011，59（13）：7 506.

［8］陳科力，趙平.采用熒光猝滅法研究穗花杉雙黃酮與牛血清白蛋白的相互［J］.中南民族大學學報：自然科學版，2015，34（3）：45.

［9］ Soares S，Mateus N，Freitas VD，et al.Interaction of different polyphenols with bovine serum albumin and human salivary α-amylase by fluorescence quenching［J］.J Agric Food Chem，2007，55（16）：6 726.

［10］ Lakowicz JR，Weber G.Quenchig of proterin fluorescence by oxygen detection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond time scale［J］.Biochemistry，1973，12（21）：4 171.

［11］馬貴斌，高飛，任斌知，等.熒光法研究藥物分子與人血清白蛋白的結合作用［J］.化學學報，1995，53（12）：1 193.

［12］張愛平，郝娟，黃茜，等.三種查爾酮類化合物與人血清白蛋白相互作用及其構效關系研究［J］.分析科學學報，2013，29（1）：73.

［13］ Xu HL，Yao NN，Xu HR，et al.Characterization of the interaction between eupatorin and bovine serum albumin by spectroscopic and molecular modeling methods［J］.Int J Mol Sci，2013，14（7）：14 185.

［14］Ross PD，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20（11）：3 096.

［15］馬康，陳曉青，陳景文.熒光光譜法研究3種黃酮類化合物與BSA的相互作用［J］.光譜實驗室，2008，25（4）：662.

（編輯：劉明偉）

Study on Interaction Mechanism between 3 Kinds of Flavonoids Compounds and Human Serum Albumin by Fluorescence Spectrometry

LAN Rui1，GONG Xiaobao1，HUANG Ligua1，CHEN Zhu2，ZENG Xue2，ZHANG Baoshun1
（1.School of Pharmacy，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Dept.of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 400030，China）

OBJECTIVE：To study the interaction mechanism between flavonoids and human serum albumin（HSA），and to compare the effects of different B-ring substitutions（hydroxyl，methoxyl group）of flavonoids on macromolecular receptor.METHODS：The interaction regularity between three flavonoids with different B-ring substitutions（quercetin，hesperetin，methyl hesperetin）and HSA was studied with fluorescence spectroscopy，the fluorescence quenching types between 3 flavonoids and HSA were determined and analyzed，and the velated binding constant，binding site and thermodynamic parameters were calculated.RESULTS：The quenching constants（Ksv）and binding constants（KA）were decreased with the increase of temperatures.The number of binding site（n）was approximately equal to one，and the thermodynamic parameters ΔH＜0，ΔS＞0，the binding interaction of these compounds with macromolecules was influenced because of the difference of the B-ring substituents.CONCLUSIONS：The quenching mechanism between three flavonoids and HSA was static quenching；the number of binding site was one；the interaction force of the three compounds with HSA was mainly static electricity，and hydroxyl group in the B-ring was likely the major active group and exerted stronger binding force than methoxyl group to connect with macromolecules.

Flavonoids；Fluorescence quenching；Human serum albumin；Mechanism

O0657.32

A

1001-0408（2016）22-3054-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.10

重慶市基礎與前沿研究計劃項目（No.cstc2013jcyjA10070，cstc2014jcyjA10125）；西南大學基本科研業務費專項資金項目（No.XDJK2013B040）；重慶市教委科學技術研究項目（No. KJ132501）；重慶市衛生局醫學科研項目（No.2011-1-114）

＊本科生。研究方向：藥學專業。E-mail：424070743@qq.com

副教授，碩士生導師，博士。研究方向：天然活性物質的提取分離、結構修飾及藥理活性研究。電話：023-68251225。E-mail：zbs360@swu.edu.cn

2016-05-06

2016-06-27）