單次大劑量阿托伐他汀對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能及Rho激酶活性的影響

謝蓮娜，王麗君，王凱君，魏顯敬，解澤宙

單次大劑量阿托伐他汀對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能及Rho激酶活性的影響

謝蓮娜，王麗君，王凱君，魏顯敬，解澤宙

目的：通過觀察單次大劑量阿托伐他汀對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能及外周血白細胞Rho激酶活性的影響，探討他汀改善不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的可能機制。

方法：入選2012-08至2014-02入住我院的不穩定性心絞痛患者78例，入院當日給予阿托伐他汀80 mg一次頓服。分別于服藥前及服藥后12 h以超聲測反應性充血前后肱動脈內徑（FMD）的變化，以免疫印跡法（Western Blot）測外周血白細胞肌球蛋白輕鏈磷酸酶的肌球蛋白結合亞單位（MYPT1）及在Thr853位上磷酸化的MYPT1（p-MYPT1Thr853）蛋白表達，以p-MYPT1Thr853占總MYPT1的百分比表示Rho激酶的活性。

結果：患者服用阿托伐他汀80 mg 12 h后，FMD較治療前增加28.15% ［（6.50±1.68）% vs （8.33±1.93）%，P＜0.001］，外周血白細胞Rho激酶活性較治療前降低32.78% ［（58.91±5.22）%vs （39.6±3.85）%，P=0.002］。

結論：大劑量阿托伐他汀能快速改善不穩定性心絞痛患者的血管內皮功能，RhoA/Rho激酶通路抑制參與他汀類藥物快速改善血管內皮功能的作用。

阿托伐他汀；內皮，血管；Rho激酶；心絞痛，不穩定型

Abstract

Objective:To explore the possible mechanism of statins improving endothelial function via observing the effect of a high single dose atorvastatin on endothelial dysfunction and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity in patients with unstable angina （UA）.

Methods:A total of 78 consecutive UA patients admitted in our hospital from 2012-08 to 2014-02 were enrolled. The patients received a single dose of atorvastatin 80 mg on the day of admission. Flow-mediated vasodilation （FMD） of brachial artery was examined by high-resolution ultrasound at before and 12 hours after medication. Protein expression of phospho-specific Thr853-MYPT1 （p-MYPT1Thr853） and MYPT1 was measured by Western blot analysis； peripheral blood leukocyte Rho kinase activity was assayed by the proportion of phospho-Thr853 in myosin binding subunit of light chain phosphatase （MYPT1）.

Results:Compared to prior medication，with atorvastatin 80 mg for 12 hours，FMD was increased 28.15% as （6.50 ±1.68） % vs （8.33 ± 1.93） %，P＜0.001 and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity was decreased 32.78% as （58.91 ± 5.22） % vs （39.6 ± 3.85 ） %，P=0.002.

Conclusion:High dose atorvastatin could rapidly improve vascular endothelial dysfunction in UA patients. inhibiting of RhoA/Rho kinase pathway may involve in the effect of statins improving endothelial function.

（Chinese Circulation Journal，2016，31:746.）

他汀類藥物是臨床中廣泛使用的抗動脈粥樣硬化基礎用藥。強效降低低密度脂蛋白膽固醇是他汀類藥物臨床獲益的基礎。他汀類藥物通過抑制3-羥3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶的活性，在抑制膽固醇合成的同時減少類異戊二烯介質的生成、抑制細胞內RhoA/Rho激酶信號轉導通路的活性［1］。RhoA/Rho激酶信號轉導通路激活所致的血管內皮功能障礙在不穩定性心絞痛發病中具有重要的作用。本研究通過觀察單次大劑量阿托伐他汀對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能及外周血白細胞Rho激酶活性的影響，探討他汀改善不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的可能機制。

1　資料與方法

研究對象：入選2012-08至2014-02入住我院的不穩定性心絞痛患者78例。不穩定性心絞痛包括：初發勞累心絞痛、惡化勞累心絞痛、靜息心絞痛。排除標準：既往對他汀類藥物不耐受、有肝臟疾病史、有肌肉疾病史、腎功能不全、2周內使用他汀類藥物。

試驗步驟：符合入選條件的患者入院當日在填寫知情同意書后，一次性服阿托伐他汀80 mg。在服藥前及服藥12 h后分別取靜脈血20 ml，進行白細胞分離，用于測定Rho激酶活性；同時于服藥前及服藥12 h后進行非創傷性血管內皮功能檢查。入院次日空腹取靜脈血進行常規生化檢測包括：肝功能、腎功能、血糖、血脂等。

非創傷性血管內皮功能檢查：以反應性充血前后肱動脈內徑（FMD）的變化反映內皮依賴性血管舒張功能。應用飛利浦 SONOS 5500彩色超聲顯像儀（Agilent 科技公司，美國），分別測量患者休息時、反應性充血后肱動脈內徑。受試者測試前休息10 min，在測定肱動脈內徑基礎值（D0）后進行反應性充血試驗：將血壓計袖帶置于肘上，沖氣加壓至250 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），4min后迅速將袖帶放氣減壓，放氣后60～90 s內在同一部位測肱動脈的內徑（D1）。FMD=（D1-D0）/D0×100%。

白細胞分離：靜脈血20 ml加入EDTA-K+抗凝管，水平式離心機200 g離心20 min，用微量移液器吸取血漿，加入紅細胞裂解液，用水平式離心機800～1200 g離心30 min，棄上清，沉淀即為白細胞，-80℃保存，批量檢測Rho激酶活性。

Rho激酶活性測定：Rho激酶激活后在Thr853位上磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶的肌球蛋白結合亞單位（MYPT1）使肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活。應用免疫印跡法（Western Blot）測定不穩定性心絞痛患者外周血白細胞MYPT1蛋白及在Thr853位上磷酸化的MYPT-1（p-MYPT1Thr853）蛋白表達，以MYPT1磷酸化程度（p-MYPT1Thr853占總MYPT1的百分比）表示Rho激酶的活性。白細胞裂解后，高速離心，上清蛋白定量。取20 μg蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，用水浴式電轉移裝置將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜（Millipore，美國），進行免疫印跡反應。一抗：兔抗人多克隆MYPT1抗體（1：500，Santa Cruz，美國），兔抗人多克隆p-MYPT1Thr853抗體 （1：500，Santa Cruz，美國）。二抗：山羊抗兔 IgG （1：4000，福州邁新）。增強化學發光（ECL）顯色、顯影、定影。將顯色條帶膠片掃描至計算機中，應用Quantity One凝膠定量軟件（Bio-Rad，美國）對目的電泳條帶進行分析，測目的條帶的積分光密度值，記錄結果。計算MYPT1磷酸化程度：p-MYPT1Thr853積分光密度/總MYPT1積分光密度×100%（p-MYPT1Thr853/ MYPT1×100%）。

統計學處理：用SPSS 16.0統計分析軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。治療前后各參數比較用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

患者一般臨床資料：78例患者平均年齡（64.97±10.67）歲，男53例，女25例，陳舊性心肌梗死5例，既往冠狀動脈介入治療7例。患者的血漿平均甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平依次為（1.86±1.09）mmol/L、 （4.93±1.17）mmol/L、（3.08±1.15）mmol/L和（1.12±0.26）mmol/L。其他冠心病相關危險因素分布情況及心血管藥物使用情況見表1。

表1　78例患者冠心病相關危險因素及臨床用藥情況

單次大劑量他汀對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的影響：應用超聲檢測比較患者入院時及服用80 mg 阿托伐他汀12 h后FMD。該組不穩定性心絞痛患者入院時FMD為（6.50±1.68） %，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后FMD為（8.33 ±1.93）%，較入院時增加28.15%（P＜0.001）。

單次大劑量他汀對不穩定性心絞痛患者外周血白細胞Rho激酶活性的影響（圖1）：應用免疫印跡法測定患者入院時及服用80 mg阿托伐他汀 12 h后外周血白細胞MYPT1及p-MYPT1Thr853蛋白表達，計算并比較Rho激酶活性。入院時患者外周血白細胞Rho激酶活性為（58.91±5.22）%，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白細胞Rho激酶活性為（39.6±3.85）%，較入院時降低32.78%（P=0.002）。

圖1　免疫印跡法分析不穩定性心絞痛患者服用阿托伐他汀前后外周血白細胞中p-MYPT1Thr853和MYPT1蛋白水平（Rho激酶活性）

3　討論

血管內皮功能障礙是急性冠狀動脈綜合征包括不穩定性心絞痛的重要發病機制之一。基礎及臨床研究充分證實，他汀類藥物具有改善血管內皮功能的作用。早期臨床研究證實，單劑量他汀能快速改善健康受試者及穩定性冠心病患者血管內皮功能。Omori等［2］給予膽固醇水平正常的健康受試者口服單劑量西立伐他汀，結果發現，應用西立伐他汀3 h 后FMD明顯增加。Wassmann等［3］給予穩定性心絞痛患者普伐他汀40 mg一次口服，于用藥前及用藥24 h后觀察乙酰膽堿誘發的冠狀動脈痙攣，結果顯示，應用40 mg普伐他汀24 h后乙酰膽堿誘發的冠狀動脈痙攣明顯改善。近期Kono等［4］的研究顯示，單劑量匹伐他汀能在2 h內改善冠狀動脈疾病患者的外周微血管功能。

基于以上研究，本研究觀察一次口服阿托伐他汀80 mg對不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的影響，結果顯示，不穩定性心絞痛患者一次口服80 mg阿托伐他汀12 h后FMD增加28.15%，提示單次大劑量阿托伐他汀具有快速改善不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的作用。血管內皮功能障礙是急性冠狀動脈綜合征包括不穩定性心絞痛發生心血管事件及心血管死亡的重要機制，入院后即刻給予大劑量阿托伐他汀能快速改善血管內皮功能，有助于改善不穩定性心絞痛患者的臨床預后。

近年來，國內外研究者對他汀降脂以外的作用機制進行了深入的探討，證實RhoA/Rho激酶信號轉導通路廣泛參與了他汀類藥物的降脂外作用［5］。RhoA是小G蛋白超家族中的一個亞族，廣泛分布于哺乳動物的組織細胞中。膽固醇合成中的中間產物類異戊二烯介質是RhoA激活的必要物質基礎。這些類異戊二烯介質與RhoA的C末端相連，增加RhoA的親脂性 （異戊烯化），促使其定位在細胞膜上而激活。Rho激酶是160 kDa的蛋白絲氨酸/酪氨酸激酶，是RhoA的主要效應蛋白。RhoA激活后通過激活Rho激酶發揮其重要生理功能。他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶，在抑制膽固醇合成的同時，減少類異戊二烯介質的生成，抑制RhoA的異戊烯化，進而抑制Rho激酶的活性［1］。有關他汀類藥物抑制Rho激酶活性的作用已在基礎研究方面獲得充分的驗證。RhoA/Rho激酶信號轉導通路是一氧化氮合酶（eNOS）表達及激活的重要調節機制。體外研究證實［6］，他汀通過抑制RhoA/Rho激酶信號轉導通路活性上調eNOS表達，增強eNOS活性。既往臨床研究證實，應用他汀4周能使動脈粥樣硬化患者外周血白細胞Rho激酶的活性降低40%～53%，同時明顯改善內皮依賴性血管舒張功能［7，8］。但應用他汀4周的結論并不能用于解釋短期負荷他汀所帶來的臨床獲益［9］。ARMYDA-RECAPTURE研究證實，在冠狀動脈介入術前12 h負荷80 mg阿托伐他汀能明顯減少冠狀動脈介入術后30 d主要心血管事件［10］。基于此，本研究觀察阿托伐他汀80 mg 一次口服對不穩定性心絞痛患者外周血白細胞Rho激酶活性的影響，結果顯示，不穩定性心絞痛患者一次口服阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白細胞Rho激酶活性較治療前降低32.78%，提示大劑量他汀能快速抑制不穩定性心絞痛患者Rho激酶的活性。Wolfrum等［11］通過人大隱靜脈內皮細胞培養發現，Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾能在15 min內激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K/ Akt）信號轉導通路，使一氧化氮（NO） 釋放增加4倍。綜合上述研究結果，推測抑制RhoA/Rho激酶信號轉導通路活性是單次大劑量阿托伐他汀快速改善不穩定性心絞痛患者血管內皮功能的重要機制。

此外，阿托伐他汀能快速改善血管內皮功能可能部分是源于其脂溶性特征。由于細胞膜由雙層脂質組成，他汀的細胞內作用效果在脂溶性他汀和水溶性他汀之間是不同的。Jantzen等［12］研究顯示，糖尿病患者脂溶性他汀西立伐他汀在12 h內增加eNOS表達的作用強于水溶性他汀瑞舒伐他汀。因此阿托伐他汀能快速進入血管壁、抑制血管內皮細胞Rho激酶活性、增加NO的生物利用度是其快速改善血管內皮功能的機制之一。

本文局限性：外周血白細胞Rho激酶活性只是間接反映血管組織Rho激酶活性。

綜上所述，我們認為，大劑量阿托伐他汀能快速改善不穩定性心絞痛患者的血管內皮功能，RhoA/ Rho激酶通路抑制參與他汀類藥物快速改善血管內皮功能的作用。

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Effect of a High Single Dose Atorvastatin on Endothelial Function and Rho Kinase Activity in Patients With Unstable Angina

XIE Lian-na，WANG Li-jun，WANG Kai-jun，WEI Xian-jing，XIE Ze-zhou.
Department of Cardiology，Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian （116001），Liaoning，China
Corresponding Author: XIE Lian-na，Email: xieln1963@163.com

Atorvastatin； Endothelial function； Rho kinase； Unstable angina

2015-11-21）

（編輯：朱柳媛）

2011年大連市醫學衛生科學技術研究項目

116001遼寧省大連市，大連大學附屬中山醫院循環科

謝蓮娜主任醫師博士主要專業方向：心血管疾病臨床診治、冠心病介入治療、冠脈痙攣機制探討Email： xieln1963@163.com通訊作者：謝蓮娜

R541.4

A

1000-3614（2016）08-0746-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.08.005