以右旋糖酐發酵廢液為原料發酵生產丁二酸

查鑫華，鄭璞*，陳鵬程，魏哲

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214112) 2(山東金洋藥業有限公司，山東 淄博，255100)

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以右旋糖酐發酵廢液為原料發酵生產丁二酸

查鑫華1，鄭璞1*，陳鵬程1，魏哲2

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214112) 2(山東金洋藥業有限公司，山東 淄博，255100)

以右旋糖酐發酵廢液為原料利用琥珀酸放線桿菌發酵生產丁二酸，在比較不同糖濃度廢液對發酵產酸影響的基礎上，通過Plackett-Burman試驗篩選出對搖瓶發酵產丁二酸的主要影響因素 NaH2PO4·2H2O，并用單因素試驗確定其最適質量濃度為 2.8 g/L。在3 L發酵罐上進行分批發酵和補料分批發酵，以 60 g/L 初糖質量濃度的右旋糖酐發酵廢液為碳源，分批發酵 46.8 h產丁二酸 40.5 g/L；采用30 g/L葡萄糖為起始發酵培養基的碳源，后續補加濃縮右旋糖酐發酵廢液的方式進行補料分批發酵，丁二酸質量濃度達到 55.0 g/L，生產強度 1 g/(L·h)，糖酸轉化率為 0.83 g/g。結果表明：以右旋糖酐發酵廢液為原料發酵生產丁二酸，為解決廢液處理排放提供了新途徑，具有良好的應用前景。

右旋糖酐發酵廢液；培養基優化；補料分批發酵；丁二酸

右旋糖酐發酵廢液 (WFBD) 是生物法生產右旋糖酐過程中提取產物之后剩下的發酵液，一般被作為工業廢水進行環保處理，但給企業增加額外的環保處理費用。右旋糖酐是一種高分子葡萄糖聚合物，是最早使用和得到公認的一種優良血漿代用品，在醫藥、食品和石油等方面都有著廣泛的應用[1]。右旋糖酐也是世界上第一個工業化生產的微生物多糖，高濃度蔗糖通過腸膜明串珠菌發酵，生成高分子葡萄糖聚合物，再經過精制處理得到不同分子量的右旋糖酐產品[2]。右旋糖酐發酵廢液中存在較高濃度的果糖和少量葡萄糖，人們嘗試了從發酵廢液中提取果糖[3]、發酵生產飼用復合酶制劑[4]、發酵生產衣康酸[5]等方面的研究。

丁二酸是一種重要的 C4平臺化合物，目前已廣泛應用于食品、醫藥、農業等領域[6]，在將來還可作為生產可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚酯多元醇、增塑劑、聚氨酯和原材料型化學產品 1,4-丁二醇的基礎材料，應用前景十分廣闊[7-8]。琥珀酸放線桿菌具有利用多種碳源(葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖等)發酵生產丁二酸的特性[9]。本文首次報道了利用右旋糖酐發酵廢液發酵生產丁二酸，涉及發酵培養基的優化、補料分批發酵工藝，以期為解決右旋糖酐發酵廢液的處理提供新途徑，實現其廢物利用的價值，同時也能進一步降低生物基丁二酸的生產成本。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes) CCTCC M2012036，由本實驗室自主篩選誘變得到，保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)[10]。

1.1.2原料

右旋糖酐發酵廢液由山東金洋藥業有限公司提供，原廢液濃縮4倍后葡萄糖 14.9±0.3 g/L，果糖 92.7±0.5 g/L。

1.1.3培養基

種子培養基參見文獻[11]。

發酵培養基(除碳源外)參見文獻[11]。

1.2方法

1.2.1發酵方法

搖瓶發酵：以右旋糖酐發酵廢液為母液，補加發酵培養基中其他成分，配制總還原糖(葡萄糖+果糖)質量濃度60 g/L 的發酵培養基，分裝體積25 mL，121℃滅菌20 min，接種量4%(體積分數)，38 ℃下CO2環境中厭氧培養48 h，分析發酵液中糖及有機酸含量。

不同比例葡萄糖與果糖的WFBD組和模擬組的對照試驗：WFBD組以右旋糖酐發酵廢液為母液，添加外源葡萄糖配制發酵培養基，果糖(g/L)/葡萄糖(g/L)分別設置50∶10、45∶15、40∶20、35∶25和30∶30 五個比例梯度；模擬組中完全不使用右旋糖酐發酵廢液，以純果糖和葡萄糖作為碳源配制發酵培養基，果糖與葡萄糖的比例設置同于WFBD組。

發酵罐分批發酵：裝液量1.6 L，接種量10% (體積分數)，溫度38 ℃，轉速200 r/min，發酵過程中以MgCO3控制pH 6.0～6.5，定時取樣，分析發酵液中糖及有機酸含量。

發酵罐補料分批發酵(兩種不同補料方式)：①以右旋糖酐發酵廢液為碳源配制發酵培養基，初始還原糖質量濃度約50 g/L，隨著發酵進行緩慢流加 500 g/L 高質量濃度外源葡萄糖，控制發酵液中葡萄糖質量濃度在 10～15 g/L(A)。②以30 g/L葡萄糖為碳源配制發酵培養基，待發酵液中葡萄糖消耗至10 g/L 左右間歇流加還原糖濃度約300 g/L的濃縮右旋糖酐發酵廢液，控制總糖質量濃度在30 g/L以下(B)。

1.2.2Plackett-Burman(PB) 試驗設計

使用MINITAB軟件設計9因素PB試驗[12-14]，原發酵培養基組分濃度作為低水平，高水平選取低水平濃度的1.25倍，培養基配制及發酵方法如1.2.1搖瓶發酵所示，以最終丁二酸產量作為效應值，設計試驗次數20次，增加兩次中心點試驗以利于誤差分析，則總試驗次數為22次，試驗設計如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗設計

注：每組數據平行3次，取平均值。

1.2.3分析方法

菌體濃度測量采用比濁法[15]，糖及有機酸的測量采用高效液相色譜法[16]。

2　結果與討論

2.1不同發酵廢液糖濃度對搖瓶發酵產丁二酸的影響

以右旋糖酐發酵廢液來配制不同初始糖濃度的發酵培養基，考察發酵廢液的糖濃度對丁二酸發酵的影響，結果如表2所示。隨著初始糖濃度的增加，菌體OD值、丁二酸產量和糖酸轉化率均呈現出先升后降的趨勢，當初始糖濃度為60 g/L 時，丁二酸產量為35.3 g/L，糖酸轉化率達到最高值0.65 g/g，而當初始糖濃度高于60 g/L 時，糖酸轉化率則開始下降，殘糖增加，同時菌體OD值也處于下降趨勢，這說明高濃度的初糖會抑制琥珀酸放線桿菌的生長及產酸，這與陶生濤[17]用甘蔗渣水解液發酵產丁二酸的結果一致。

表2　不同初始糖濃度對發酵結果的影響

注：每組數據平行3次，取平均值。

2.2以Plackett-Burman 試驗優化發酵培養基組分濃度

在確定碳源糖質量濃度為60 g/L時，采用PB試驗篩選發酵培養基中主要影響因子，試驗設計及效應值丁二酸產量見方法1.2.2，結果處理見表3。

表3　Plackett-Burman試驗結果分析

根據以上數據，按各因素的P值大小排序，P值越小其對應因素對效應值影響越大，則原培養基組分中對丁二酸產量影響值由大到小分別排列為：NaH2PO4·2H2O>NaCl>K2HPO4·3H2O>葉酸>玉米漿>無水CaCl2>Na2S>生物素>MgCl2·6 H2O，因NaH2PO4·2H2O的P值(0.306) 遠小于其他培養基組分的P值(>0.5)，所以NaH2PO4·2H2O是發酵培養基組分中對丁二酸產量影響的最主要因素，這可能是因為右旋糖酐發酵廢液中殘留的磷酸鹽破壞了原始培養基中磷酸鹽緩沖體系的平衡，影響了細胞周圍的微環境，最終影響到菌體產酸。

對NaH2PO4·2H2O的濃度作單因素試驗，選取2.0～3.0 g/L共6個梯度來優化NaH2PO4·2H2O的濃度，通過比較其菌體濃度、殘糖量及丁二酸產量來篩選最優濃度，結果如圖1所示。

圖1　不同NaH2PO4·2H2O 質量濃度對發酵產丁二酸的影響Fig.1　Effects of various concentration of NaH2PO4·2H2O on succinic acid fermentation

當NaH2PO4·2H2O濃度在2.0～3.0 g/L之間時，菌體濃度的變化不大，即NaH2PO4·2H2O濃度對菌體生長影響比較小；在丁二酸產量方面，當NaH2PO4·2H2O濃度由2.0升高到2.4 g/L 時，丁二酸產量隨之升高明顯，當NaH2PO4·2H2O濃度高于 2.8 g/L 時丁二酸產量則開始下降，相應的殘糖量也隨著這個規律而呈現先降后升的趨勢。所以最優的NaH2PO4·2H2O濃度為2.8 g/L，該濃度下最利于菌體產酸及充分利用右旋糖酐發酵廢液中糖分。

2.3琥珀酸放線桿菌利用葡萄糖與果糖的區別

右旋糖酐發酵廢液中只含有果糖和葡萄糖兩種糖分，弄清這兩種單糖對菌體生長及產酸的區別對提高產量有指導意義。如方法1.2.1中設計不同比例葡萄糖與果糖的WFBD組和模擬組的對照試驗，以探究菌體利用葡萄糖與果糖的區別，同時確證右旋糖酐發酵廢液中是否有抑制菌體生長及產酸的成分存在，結果如圖2所示。

圖2　不同比例葡萄糖與果糖對菌體生長及產酸的影響Fig.2　Effects of different proportion of glucose and fructose on cell growth and succinic acid production

在總糖濃度不變的情況下，隨著葡萄糖的含量不斷升高，菌體濃度和丁二酸產量也在增加，不管是WFBD組還是模擬組都呈現出相同的規律，這說明葡萄糖比果糖更利于被菌體吸收利用，更能促進菌體的生長和產酸過程。另外，分別從菌體的生長和產酸來看，模擬組的發酵結果均優于WFBD組，表明右旋糖酐發酵廢液中確實存在抑制菌體生長和產酸的成分。

2.4右旋糖酐發酵廢液為碳源分批發酵產丁二酸

在3 L發酵罐中考察以右旋糖酐發酵廢液為唯一碳源發酵產丁二酸的情況，從圖3可以看出，發酵液中葡萄糖很快被消耗完，當發酵進行至16 h時，菌體OD值達到最大6.18，40 h之后果糖消耗速率和丁二酸產生速率開始急劇下降，至46.8 h 發酵結束時發酵液中各組分濃度基本不變，最終產丁二酸40.5 g/L，果糖殘余量較高，整個發酵過程總耗糖速率為1.01g/L，丁二酸生產強度為0.87 g/L/h，糖酸轉化率為0.83 g/g。劉璇[11]等以葡萄糖為碳源進行分批發酵時，以50 g/L 葡萄糖為底物發酵32 h產丁二酸40.7 g/L，生產強度1.27 g/(L·h)，糖酸轉化率0.81 g/g，相比較下，以右旋糖酐發酵廢液為碳源進行發酵的缺陷在于發酵速率慢，生產強度比以葡萄糖為碳源時低46%，且殘糖高，糖利用不徹底。

圖3　右旋糖酐發酵廢液分批發酵產丁二酸Fig.3　Batch fermentation on waste fermentation broth of dextran forsuccinic acid production

2.5右旋糖酐發酵廢液與外源葡萄糖混合補料分批發酵產丁二酸

補料分批發酵可以有效提高丁二酸的產量，2.3的結果顯示葡萄糖比果糖更利于菌體的生長及產酸，選擇初始發酵用右旋糖酐發酵廢液培養基，后續流加葡萄糖(A)和初始發酵用葡萄糖培養基，后續流加濃縮右旋糖酐發酵廢液(B)兩種補料方式，進行補料分批發酵，見方法1.2.1，其發酵過程如圖4所示。

圖4　右旋糖酐發酵廢液與外源葡萄糖混合補料分批發酵產丁二酸Fig.4　Fed-batch fermentation on waste fermentation broth of dextran and exogenous glucose forsuccinic acid production注：圖A為補料方式①發酵曲線，0 h即開始緩慢流加外源葡萄糖，圖B為補料方式②發酵曲線，圖中箭頭處 8h開始間歇流加濃縮 WFBD。

圖4A菌體生長略遜于圖4B，這可能是由于B中初始發酵液以葡萄糖為唯一碳源，培養基中沒有右旋糖酐發酵廢液存在，菌體生長未受不明成分影響。兩種補料方式發酵液最終的丁二酸質量濃度雖然接近，分別是53.8 g/L 和55.0 g/L，但由于補料方式的不同造成不同的體積稀釋效應，實際上B補料方式中生產的丁二酸量更多，具體的參數比較見表4。

從表4數據可以得知，補料方式B殘糖濃度低，添加外源葡萄糖量少，單次發酵使用的右旋糖酐發酵廢液多，產生的丁二酸量多，且糖酸轉化率也更高，說明補料方式B明顯優于A，相對于分批發酵，丁二酸產物濃度提高了 35.8%。

2.6不同原料發酵產丁二酸的比較

利用廢棄原料是發酵法生產丁二酸的研究熱點之一，主要有秸稈、酒糟、甘蔗渣、糖蜜等，如表5所示，與其他廢棄原料相比，右旋糖酐發酵廢液發酵的丁二酸產量相對較高，且發酵操作簡單，無需水解過程，因此是一種具有良好應用前景的原料。

表4　兩種補料分批發酵的參數比較

表5　不同原料發酵產丁二酸

3　結論

本文率先報道了以右旋糖酐發酵廢液為碳源，利用琥珀酸放線桿菌發酵丁二酸。研究表明：右旋糖酐發酵廢液作為碳源對發酵有一定影響，優化發酵培養基中的NaH2PO4·2H2O濃度，搖瓶產丁二酸提高22.3%；以 60 g/L 初糖質量濃度的右旋糖酐發酵廢液為碳源進行分批發酵，發酵 46.8 h產丁二酸40.5 g/L，采用發酵起始以低葡萄糖濃度培養基，后續補加濃縮右旋糖酐發酵廢液的方式進行補料分批發酵，最終產丁二酸 55.0 g/L，相對于分批發酵提高 35.8%，生產強度 1 g/L/h，糖酸轉化率為 0.83 g/g；與其它廢棄原料比較，右旋糖酐發酵廢液具有不需水解、操作步驟簡單的優勢，且丁二酸產量相對較高，應用前景良好。

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Fermentative succinic acid production from waste fermentation broth of dextran

ZHA Xin-hua1, ZHENG Pu1*, CHEN Peng-cheng1, WEI Zhe2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Shandong Jinyang Pharmaceutical Company Limited,Zibo 255100,China)

In this paper, succinic acid production by Actinobacillus succinogenes from waste fermentation broth of dextran was studied. After comparing the effect of initial sugar concentrations on succinic acid production, Plackett-Burman experiment was used to determine that NaH2PO4·2H2O was the most important factor in succinic acid production. Results from single factor experiment suggested that the optimal concentration of NaH2PO4·2H2O was 2.8 g/L for the following fermentation tests. Condensed waste fermentation broth of dextran with reducing sugar concentration of 60 g/L was used as the carbon source for batch fermentation in a 3 L fermentor, and 40.5 g/L succinic acid concentration was achieved after 46.8 h. In the fed-batch fermentation, an initial carbon source of 30 g/L glucose solution was added, followed by condensed waste fermentation broth of dextran, leading to an eventual succinic acid concentration of 55.0 g/L with a productivity of 1 g/(L·h) and conversion rate of 0.83 g/g. This work not only provided a new and efficient way to produce succinic acid using cheap raw materials, but also offered a significant promising method for solving the problems of waste liquid emission.

waste fermentation broth of dextran;optimize culture medium;fed-batch fermentation; succinic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601002

碩士研究生(鄭璞教授為通訊作者，E-mail: zhengpu @ jiangnan.edu.cn)。

江蘇省產學研項目(2015 BY2015019-37)；國家 863支持項目 (2006 AA027235)

2015-09-30，改回日期：2015-10-12