梔子石油醚有效部位的快速抗抑郁潛力與BDNF、p-eEF2的表達上調相關

任　荔，陶偉偉，柴　毅，李守雪，王　省，張煜萱，陳　麗，夏寶妹,吳顥昕,陳　剛

(南京中醫藥大學1.基礎醫學院轉化系統生物學與神經科學研究中心;2.中醫腦病重點實驗室，江蘇 南京　210023)

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梔子石油醚有效部位的快速抗抑郁潛力與BDNF、p-eEF2的表達上調相關

任荔1,2，陶偉偉1,2，柴毅1,2，李守雪1,2，王省1,2，張煜萱1,2，陳麗1,2，夏寶妹1,2,吳顥昕1,2,陳剛1,2

(南京中醫藥大學1.基礎醫學院轉化系統生物學與神經科學研究中心;2.中醫腦病重點實驗室，江蘇 南京210023)

目的篩選出梔子石油醚有效部位具有快速抗抑郁潛力并對其初始起效時間點及生物學機制進行了探討。方法采用給藥后24 h進行小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗和新奇抑制攝食實驗來初步篩選具有快速抗抑郁潛力的梔子石油醚有效部位。給藥30 min后進行懸尾行為實驗及給藥2 h后進行強迫游泳實驗以測試梔子石油醚有效部位起效時間。Western blot實驗檢測2 h及24 h小鼠海馬區BDNF及p-eEF2蛋白的表達。結果單次給藥GJ-PE1后2 h到24 h均能降低小鼠強迫游泳行為的不動時間, 同時降低小鼠陌生環境下攝食的潛伏時間。GJ-PE3單次給藥24 h后能降低小鼠陌生環境下攝食的潛伏時間。GJ-PE4給藥24 h后能增加小鼠陌生環境下的攝食量。給藥2 h后，GJ-PE1小鼠海馬中的BDNF表達明顯上調而p-eEF2表達明顯下調，24 h后小鼠海馬中BDNF表達明顯下調而p-eEF2表達明顯上調。結論梔子石油醚的4個下分部位中，GJ-PE1最具有快速抗抑郁潛力,起效時間為給藥后2 h，其機制與BDNF的上調及p-eEF2的下調相關。GJ-PE3、GJ-PE4具有部分潛在快速起效抗抑郁藥物的特征。GJ-PE2不具有快速抗抑郁潛力。

梔子；石油醚有效部位；快速抗抑郁；BDNF；p-eEF2；氯胺酮

隨著社會競爭的日益激烈，抑郁癥的發病率也在逐年增加。據世界衛生組織統計，抑郁癥已成為世界第四大疾患，預計到2020年，可能成為僅次于冠心病的第二大疾病[1]。目前主流抗抑郁藥起效緩慢、首次用藥有效率低、不良反應多等局限性，降低了患者用藥的依從性，不利于重癥抑郁患者自殺風險的防范。因此，臨床迫切需要尋找和研制起效快、療效好以及副作用小的抗抑郁藥物[2]。

梔子來源于茜草科Rubiaceae植物梔子Capejasmine的干燥成熟果實。 中醫謂其“性寒味苦, 歸心肺三焦經, 具有泄火除煩, 清熱利尿, 涼血解毒之功效”。以梔子為主要藥物組分的復方研究中發現其有明顯的抗抑郁作用[3]。本實驗室前期的研究發現傳統中藥方劑越鞠丸具有快速起效抗抑郁作用[4]，確認了其石油醚部位具有快速起效抗抑郁潛力[5]，并發現在越鞠丸快速起效抗抑郁中起關鍵作用的藥物組分為梔子[6]。在此基礎上，對梔子下分部位進行的研究發現，梔子石油醚部位具有快速起效抗抑郁作用，其機制與BDNF及其特異性受體TrkB的激活相關[7]。本實驗進一步對梔子石油醚的下分部位進行了研究，以明確其快速起效時程及探討其相關生物學機制，從而為快速起效抗抑郁藥物的新藥研發提供臨床前依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康昆明種小鼠160只，體質量20～25 g，♂，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SCXK(蘇)2011-0003。動物房室溫25℃，濕度45%，晝夜交替12 h,動物自由飲食進水。

1.2實驗藥物梔子石油醚有效部位(689.9 g)經硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(100 ∶0～50 ∶50)得到4個組分(GJ-PE1、GJ-PE2、GJ-PE3、GJ-PE4)，各組分別采用1L旋轉蒸發儀(河南鞏義予華儀器設備有限責任公司，產品型號：501)濃縮得到浸膏，各部位浸膏均采用1%的吐溫-80溶解。鹽酸氯胺酮(ketamine)注射液為福建古田制藥廠生產(批號：20140301)。使用時用0.9%生理鹽水配成30 g·L-1的藥液。

2　方法

2.1分組與給藥160只小鼠分3批實驗進行。首先進行梔子石油醚4個部位給藥后24 h的快速抗抑郁篩藥測試，以確定具有快速抗抑郁潛力的梔子石油醚下分部位。之后分別進行30 min和2 h的行為測試，以確定具有快速起效抗抑郁潛力的梔子石油醚有效部位的初始起效時間。

24 h測試：60只♂小鼠分為空白組、GJ-PE的4個部位(按照梔子石油醚部位[7]有效劑量折算)：GJ-PE1組(0.07 g·kg-1)、GJ-PE2組(0.08 g·kg-1)、GJ-PE3組(0.01 g·kg-1)、GJ-PE4組(0.5 g·kg-1)以及氯胺酮組(30 mg·kg-1)。灌胃24 h后依次進行小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗和陌生環境攝食。

30 min測試：50只♂小鼠分為空白組、GJ-PE的3個部位組以及氯胺酮組(30 mg·kg-1)。灌胃，30 min后進行小鼠懸尾實驗。

2 h測試：50只♂小鼠分為空白組與GJ-PE的3個部位組以及氯胺酮組(30 mg·kg-1)。灌胃，2 h后進行小鼠強迫游泳實驗。

2.2行為學測試

2.2.1小鼠懸尾實驗(TST)將單個小鼠尾端用膠布粘在懸掛鉤上面，尾尖距膠布約1 cm。將小鼠放入通用隔音行為箱內，使其成倒掛狀態，頭部離箱底20 cm。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，活動一段時間后出現間斷性不動，顯示絕望狀態。小鼠懸尾視頻分析系統3.0版(上海吉量軟件公司)記錄6 min內小鼠的活動情況，前2 min為小鼠的懸尾適應期，分析后4 min內小鼠的不動時間[5]。

2.2.2小鼠強迫游泳(FST)實驗前1 h空調調整行為房溫度至26℃，將3L水灌入5 L(直徑18 cm×高25 cm)的玻璃燒杯中，水溫調至24℃～26℃。之后將小鼠依次放入隔音行為箱中，強迫游泳視頻分析系統3.0版(上海吉量軟件公司)記錄小鼠6 min內的活動。前2 min為小鼠的游泳適應期，分析后4 min內小鼠游泳的總不動時間，即小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動[8]。

2.2.3新奇抑制攝食實驗(novelty suppressed feeding test, NSFT)小鼠禁食24 h后，依次從固定角落被放入一個新的空鼠籠內，中心放置已稱重的糧食。放入后，檢測小鼠首次進食的潛伏時間。小鼠進食標準為開始咀嚼食物，而不僅僅嗅食或擺弄食物。以吃食的潛伏期和消耗食物的重量為觀測指標[8]。單位時間攝食量計算公式為：單位時間攝食量/g=10 min內消耗糧食重量(g)/小鼠體重(g)

2.3Western blotWestern blot檢測BDNF、p-eEF2、eEF2水平: 24 h及2 h行為實驗結束后，分別處死兩批小鼠中的空白組、GJ-PE1組及氯胺酮組，冰上取腦，并提取小鼠海馬蛋白，用Nanodrop測定樣品中蛋白濃度。根據BDNF、p-eEF2 、eEF2的分子量選擇SDS-PAGE膠(分別為15%、8%、8%的膠)電泳(Bio-Rad電泳系統)分離蛋白質，300 mA恒流冰浴轉膜，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將裁剪好的PVDF膜分別放入1%的BSA中室溫搖床震蕩1h，然后將膜分別放入加有BDNF(Santa Cruz, sc-546, 1 ∶200)、p-eEF2(CellSignaling Technology, 貨號：2331S)、eEF2(Cell Signaling Technology, 貨號：2332S)、β-tubulin (Proteintech, 10094-1-AP, 1:2000)抗體的抗體盒中，4℃冰箱搖床過夜。次日TBST緩沖液漂洗3次后，將PVDF膜分別放入加有羊抗兔二抗(Proteintech, SA00001-2, 1 ∶2 000)的抗體盒中，室溫孵育1h，ECL(康為世紀，貨號：CW0048C)顯影。凝膠成像及分析系統(Tannon)采集BDNF、p-eEF2、eEF2及Tubulin條帶灰度值，分析各樣本BDNF、p-eEF2、eEF2與Tubulin的灰度值。

3　結果

3.1給予梔子石油醚4個部位24 h后對小鼠懸尾實驗的影響給藥24 h后，梔子石油醚4個部位組在小鼠懸尾上不動時間與空白組相比差異均無顯著性(P>0.05)。Ket組與空白組相比不動時間明顯縮短(P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1　Immobility time in tail suspension test at 24 h after a single treatment of four fractions(n=10)

*P<0.05vscontrol

3.2給予梔子石油醚4個部位24 h后對小鼠強迫游泳實驗的影響給藥24 h后，與空白組相比，GJ-PE1組及Ket組在強迫游泳上不動時間明顯降低(P<0.01)，其余3個部位組差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 2。

Fig 2　Immobility time in forced swimming test at 24 h after a single treatment of four fractions(n=10)

**P<0.01vscontrol

3.3給予梔子石油醚4個部位24 h后對小鼠新奇抑制攝食實驗的影響給藥24 h后，與空白組相比，GJ-PE4組和Ket組在陌生環境中的單位時間攝食量明顯增加(P<0.01，P<0.05)，其余各部位組與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)。與空白組相比，GJ-PE1、GJ-PE3和Ket組在陌生環境中的攝食潛伏期明顯縮短(P<0.01，P<0.05,P<0.05)，GJ-PE2、GJ-PE4組差異無顯著性(P>0.05),見Fig 3,4。

Fig 3　Unit food comsumptions in novelty suppressed-feeding test at 24 h after a single treatment of four fractions(n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4給予梔子石油醚3個有效部位30 min后對小鼠懸尾實驗的影響給藥30 min后，與空白組相比,梔子石油醚3個部位在小鼠懸尾上不動時間均差異無顯著性(P>0.05),Ket組在小鼠懸尾實驗上不動時間明顯降低(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 4　Latency time at 24 h after a single treatment of four fractions(n=10)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 5　Immobility time in tail suspension test at 30 min after a single treatment of three fractions(n=10)

*P<0.05vscontrol

3.5給予梔子石油醚3個部位2 h后對小鼠強迫游泳實驗的影響給藥2 h后，與空白組相比,GJ-PE1和Ket組在小鼠強迫游泳實驗上不動時間明顯降低(P<0.05)，其余部位組與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 6。

Fig 6　Immobility time in forced swimming test at 2 h after a single treatment of three fractions(n=10)

*P<0.05vscontrol

3.6給藥2 h后梔子石油醚有效部位GJ-PE1給藥的小鼠海馬BDNF及p-eEF2的Western blot檢測結果給藥2 h后，與空白組相比，GJ-PE1組和Ket組小鼠海馬BDNF的表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01);與空白組相比，梔子石油醚有效部位組和Ket組小鼠海馬p-eEF2的表達均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 7。

3.7給藥24 h后梔子石油醚有效部位GJ-PE1給藥的小鼠海馬BDNF及p-eEF2的Western blot檢測結果給藥24 h后，與空白組相比，GJ-PE1組小鼠海馬BDNF的表達明顯降低(P<0.05)，Ket組小鼠海馬BDNF的表達明顯升高(P<0.01)；與空白組相比，GJ-PE1組小鼠海馬的p-eEF2表達明顯升高而Ket組小鼠海馬的p-eEF2表達明顯降低(P<0.05)，見Fig 8。

Fig 7　BDNF and p-eEF2 expressions in hippocampus at 2 h after GJ-PE1 treatment(n=7)*P<0.05,**P<0.01 vs control

Fig 8　BDNF and p-eEF2 expressions in hippocampus at 24 h after GJ-PE1 treatment(n=7)*P<0.05,**P<0.01 vs control

4　討論

谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR )的拮抗劑氯胺酮為公認的具有快速起效抗抑郁作用的藥物，它同時也是快速起效抗抑郁研究的原型藥[9]。臨床研究發現，低劑量氯胺酮在給藥30～40 min后開始起效[10]。雖然氯胺酮的體內代謝半衰期只有3 h[11]，其單次給藥后的抗抑郁效果卻能持續7 d[10]。本實驗室前期的動物實驗研究發現，與氯胺酮類似，單次給予梔子石油醚部位能夠減輕動物的抑郁樣癥狀[7]，而常規單胺類藥物在此模型上至少需要7 d以上才能發揮作用[12]，體現出梔子石油醚部位具有快速抗抑郁特性。

小鼠懸尾和強迫游泳實驗是兩種對抗抑郁藥敏感的行為絕望模型，常用于抗抑郁藥的初篩。兩個實驗中小鼠不動時間的延長模擬了人類抑郁癥中的“絕望”狀態。新奇抑制攝食實驗是根據測量在一個新環境中動物的抑郁潛伏期和食物消耗量的減退情況來模擬出一個長期的抑郁模型[13]。本研究采用這3種小鼠抑郁行為實驗來篩選梔子石油醚4個下分部位中最具有快速抗抑郁潛力的部位，并進一步探討其初始起效時間。

腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是目前研究較多的與抑郁癥發病及抗抑郁作用相關的蛋白[14]。抑郁癥的發生與神經可塑性的損傷密切相關。BDNF能促進神經發生及調節神經可塑性。臨床研究發現抑郁癥患者海馬部位及前額葉皮層部位BDNF水平明顯減少[15]。動物實驗也證實，誘發抑郁癥的壓力應激會導致動物海馬部位BDNF mRNA表達減少[16]。而抗抑郁藥物治療能夠導致動物海馬部位BDNF水平升高[17]。真核細胞肽鏈延伸因子-2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinase，eEF2K) 是一類鈣離子/鈣調蛋白依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶，并在調控蛋白質翻譯的延長過程中發揮重要作用[18]。eEF2K目前已知的唯一底物是eEF-2(真核生物肽鏈延伸因子-2)。eEF2通過誘導肽基轉運RNA從核糖體A位到P位的移位而使肽鏈進一步延伸。eEF2激酶通過磷酸化eEF-2上的蘇氨酸56位點降低其與核糖體的親和力從而終止肽鏈延伸[19]。研究發現給予氯胺酮30 min至2 h內，eEF2的磷酸化水平迅速降低，表明了其活性的增加[2]。Autry等[20]報道快速抗抑郁藥物氯胺酮可能通過快速降低eEF2磷酸化水平，從而對BDNF的翻譯去抑制，以達到快速增加BDNF合成，增強突觸應答來實現快速抗抑郁作用。

本研究將3批動物分為3個時間點進行測試。研究首先分別對給予梔子石油醚4個部位后24 h的小鼠進行了懸尾、強迫游泳和新奇抑制攝食實驗。結果顯示，GJ-PE1給藥后24 h明顯縮短了小鼠的游泳不動時間，同時減少了小鼠在新奇抑制攝食實驗的潛伏時間。GJ-PE3僅減少了24 h后小鼠在新奇抑制攝食實驗的潛伏時間。GJ-PE4僅增加了給藥24 h后小鼠新奇抑制攝食實驗的單位時間攝食量。而GJ-PE2給藥24 h后在3種行為測試中均未表現出抗抑郁作用。因此我們認為GJ-PE2不具有快速起效抗抑郁潛力。在初始起效時間點實驗中我們排除了GJ-PE2，僅對GJ-PE1、GJ-PE3、GJ-PE4 3個部位進行測試。給藥30 min后的小鼠懸尾測試結果顯示，梔子石油醚的這3個部位在給藥后30 min均未顯示出抗抑郁作用。我們又選取了梔子快速抗抑郁初始起效時間點2 h作為測試時程[6]。結果顯示GJ-PE1在給藥后2 h明顯縮短了小鼠的游泳不動時間。行為學研究結果表明GJ-PE1、GJ-PE3、GJ-PE4均具有快速起效抗抑郁潛力，其中GJ-PE1具有快速起效，抗抑郁的潛力最大，且其最快起效時間為給藥后2 h。GJ-PE2不具有快速抗抑郁潛力。

分子機制研究中，與前期越鞠丸實驗結果類似[4]，GJ-PE1降低了給藥24 h后小鼠海馬中BDNF的表達，增加了磷酸化eEF2的表達。這表明給藥后24 h，GJ-PE1激活了eEF2，并導致了BDNF的翻譯抑制。與越鞠丸[4]及越鞠丸石油醚部位研究[5]結果不同，而與梔子快速起效抗抑郁研究結果[6]相同的是，GJ-PE1在給藥后2 h，而非30 min才表現出快速抗抑郁作用。其給藥后2 h上調了BDNF并下調了磷酸化eEF2，提示其在2 h這一時間點的快速起效抗抑郁機制可能與氯胺酮快速起效抗抑郁機制類似。越鞠丸及越鞠丸石油醚部位給藥后30 min顯示出抗抑郁樣作用，同時引起了小鼠海馬BDNF表達的上調。而梔子、梔子石油醚部位及梔子石油醚有效部位GJ-PE1均在給藥后2 h才開始顯示出抗抑郁樣作用。這表明越鞠丸及越鞠丸石油醚部位30 min的抗抑郁作用可能是梔子與其它藥物組分共同作用的結果。

在目前的研究中，我們發現了梔子石油醚3個有效部位具有快速抗抑郁潛力，篩選出了GJ-PE1具有的快速抗抑郁潛力最大，并發現這種快速起效抗抑郁潛力的起效時間為給藥后2 h，其機制與BDNF的上調及p-eEF2的下調相關。而給藥后24 h，GJ-PE1的快速抗抑郁作用則可能并非BDNF的作用。影響其抗抑郁持久性方面的生物學機制值得進一步探討。越鞠丸中給藥30 min后發揮快速抗抑郁作用的物質基礎，同樣值得后期的進一步研究，以期為快速起效抗抑郁藥物的研發提供思路。

(致謝：本文實驗在南京中醫藥大學基礎醫學院轉化系統生物學與神經科學研究中心與中醫腦病校重點實驗室完成，特此致謝!)

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Potent rapid antidepressant effects of effective fraction of GJ-PE and up-regulation of BDNF and TrkB

REN Li1,2,TAO Wei-wei1,2,CHAI Yi1,2,LI Shou-xue1,2,WANG Xing1,2,ZHANG Yu-xuan1,2,CHEN Li1,2,XIA Bao-mei1,2,WU Hao-xing1,2,CHEN Gang1,2

(1.CenterforTranslationalSystemsandNeuroscience,SchoolofBasicBiomedicalScience,2.KeyLaboratoryofIntegrativeBiomedicineofBrainDiseases,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

AimTo identify whether the petroleum ether fraction of Gardenia jasminoides Ellis(GJ-PE) could effetive exhibit a rapid antidepressant effect and also to investigate the biological mechanism. MethodsTail suspension test(TST), forced swimming test(FST) and novelty suppressed-feeding(NSF) were used to screen the rapid antidepressant potential of effective fractions of GJ-PE in KM mice at 24h post a single administration. Tail suspension test (TST) was also used at 30 min and forced swimming test(FST) was used at 2 h to test the initial onset time of effective fractions of GJ-PE in KM mice. Western blot was performed to examine the expression of BDNF and p-eEF2 in hippocampus of KM mice at 2 h and 24 h. ResultsAn acute administration of GJ-PE1 decreased the immobility time of KM mice in FST at 2 h and 24 h and decreased the latency time in NSF at 24 h. GJ-PE3 decreased the latency time in NSF at 24 h. GJ-PE4 increased the unit food consumption in NSF at 24 h. At 2 h post a single GJ-PE1 treatment, the expression of BDNF was significantly up-regulated while the expression of p-eEF2 was significantly down-regulated. At 24 h post a single GJ-PE1 treatment, the expression of BDNF was significantly down-regulated while p-eEF2 expression was significantly up-regulated. ConclusionGJ-PE1 has the most significant rapid antidepressant potential among the four fractions of GJ-PE. The effective time of GJ-PE1 is 2 h after drug treatment. The mechanism of the rapid antidepressant effect of GJ-PE1 at 2 h is related to the up-regulation of BDNF and down-regulation of p-eEF2. GJ-PE3 and GJ-PE4 also have some features of rapid antidepressants. GJ-PE2 doesn′t have the rapid antidepressant potential.

Gardenia jasminoides Ellis; petroleum ether fraction; rapid antidepressant; BDNF; p-eEF2; ketamine

2016-05-18，修回稿日期：2016-06-26

國家自然科學基金(No 81403041)；江蘇省自然科學基金資助項目(No BK20151568)；江蘇省高校優勢學科支持項目(PAPD)

任荔(1988-)，女，博士生，研究方向：越鞠丸治療抑郁癥的機制，E-mail：nicolight@163.com；

陶偉偉(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中醫藥的藥效物質基礎，并列第一作者，E-mail:tw845@163.com；

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.008

A

1001-1978(2016)09-1224-07

R-332；R284.1；R322.81；R971.43；R977.6

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.016.html

陳剛(1972-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向: 抑郁癥的中醫藥機制，通訊作者，E-mail :chengang@njucm.edu.cn