含輔酶Q10的紅曲膠囊對去卵巢合并D-半乳糖大鼠股骨的影響

2016-09-28 06:50:01呂思敏司徒永立孫金影

中國藥理學通報 2016年9期

呂思敏，于　瓊，司徒永立，孫金影，崔　燎,4，吳　鐵,

(1.廣東醫科大學廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯合研究中心；2.廣東醫科大學藥學院，廣東東莞　523808；3.廣東醫科大學病原生物學與免疫學研究所，4.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東湛江　524023)

呂思敏1，于瓊2，司徒永立3，孫金影2，崔燎2,4，吳鐵1,2

(1.廣東醫科大學廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯合研究中心；2.廣東醫科大學藥學院，廣東東莞523808；3.廣東醫科大學病原生物學與免疫學研究所，4.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東湛江524023)

目的采用大鼠去卵巢合并D-半乳糖誘導老年性骨質疏松的動物模型來評價含輔酶Q10的紅曲膠囊對其股骨的骨藥理學作用，并與雌激素己烯雌酚比較。方法3 mon齡SPF級♀ SD大鼠，隨機分為假手術對照組(CON)，去卵巢組(OVX)、模型組(MOD)，己烯雌酚組(DES)和紅曲膠囊組(RYR)，連續給藥60 d。實驗結束時，取左側股骨檢測鈣、磷和羥脯氨酸含量；取右側股骨進行三點彎曲實驗，然后用Micro CT進行骨量分析。結果與CON組相比，MOD組的大鼠體重明顯增加；股骨的最大載荷、剛度、最大強度、斷裂強度、彈性模量均明顯降低；股骨的Ca、P、Hyp含量均明顯降低；Micro CT指標BV/TV、Tb.N、BMD、Conn-Dens均明顯降低，Tb.Sp、SMI均明顯增加。與MOD組相比，RYR組體重明顯降低；各力學指標均有增加的趨勢；Ca和P的含量均明顯增加；BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD、Conn-Dens均明顯增加，Tb.Sp明顯降低。與MOD組相比，DES組股骨的各項指標趨勢與RYR組相一致。但與DES組相比，RYR組體重明顯降低，Ca和P含量明顯增加，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn-Dens明顯升高，Tb.Sp、SMI明顯降低。結論去卵巢合并D-半乳糖可誘導大鼠股骨出現老年性骨質疏松的表現，含輔酶Q10的紅曲膠囊可使去卵巢合并D-半乳糖大鼠的體重明顯減輕，股骨礦物質含量丟失得到恢復；股骨的骨丟失明顯減輕，骨微觀結構得到明顯改善。且0.5顆·kg-1的紅曲膠囊在增加松質骨骨小梁數量上比30 μg·kg-1己烯雌酚效果要好。

輔酶Q10；紅曲膠囊；去卵巢；D-半乳糖；骨質疏松；己烯雌酚；大鼠

含輔酶Q10的紅曲膠囊是從中藥紅曲提取制備而成的一種創新藥物，與以往主要含有洛伐他汀及他汀同系物的紅曲膠囊不同。目前的觀點認為他汀類是紅曲膠囊降血脂的主要有效成分，臨床研究觀察到，長期應用他汀類治療高脂血癥及冠心病，常常出現肝功能損傷等不良反應，但合用輔酶Q10之后這種情況就得到改善[1]。我們在對紅曲菌絲體的研究中，發現紅曲菌絲體含有輔酶Q10，因此我們從紅曲菌絲體中提取輔酶Q10后與紅曲的他汀類成分制備成含輔酶Q10的紅曲膠囊。本研究采用大鼠去卵巢合并應用D-半乳糖誘導老年性骨質疏松的動物模型，評價該膠囊的抗衰老作用及骨藥理學作用，現報道如下。

1　材料與方法

1.1動物45只SPF級3 mon齡SD大鼠，♀，體質量(231.11±18.96)g。由廣東省中山大學實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證號碼為：SCXK(粵)2011-0029。

1.2藥物己烯雌酚注射液購于上海通用制藥股份有限公司，批號100204；D-半乳糖購于天津市光復精細化工研究所，批號20120928；紅曲膠囊由廣東醫學院醫藥科技開發中心提供，每粒紅曲膠囊含洛伐他汀為1.31 mg，輔酶Q10為6.28 μg。

1.3儀器與試劑Micro CT儀(viva CT40，SCANCO Medical AG)，BioTek Synergy 2多功能酶標儀，Eppendorf高速冷凍離心機，賽多利斯BT 25S電子天平，電感偶合等離子體發射光譜儀(ICP)，858 Mini Bionix型材料測試系統(MTS，USA)，羥脯氨酸測試盒購于南京建成生物工程研究所，批號：20130109。

1.4實驗方法45只SD大鼠適應性養1周后，根據體質量隨機分配為5組，每組9只。① 假手術組(CON)：每天灌胃蒸餾水5 mL·kg-1。② 去卵巢組(OVX)：雙側去卵巢，每天灌胃蒸餾水5 mL·kg-1。③ 模型組(MOD)：雙側去卵巢后，每天皮下注射D-半乳糖100 mg·kg-1。④ 己烯雌酚組(DES)：造模后，每天灌胃己烯雌酚30 μg·kg-1。⑤ 紅曲膠囊組(RYR)：造模后，每天灌胃紅曲膠囊0.5顆·kg-1。各組大鼠自由飲水和攝食，并連續灌胃給藥60 d。動物每周稱體重1次，并按照體重的變化來調整給藥的劑量。實驗結束時，用戊巴比妥鈉(1.5 mL·kg-1)來進行腹腔注射，大鼠麻醉后，右心室徹底抽血以處死大鼠。取左側股骨檢測骨鈣、骨磷和羥脯氨酸含量；右側股骨做三點彎曲試驗，之后再進行Micro CT檢測。

1.5觀察指標及測定方法

1.5.1大鼠體重的觀察每周稱大鼠體重1次，實驗第8周在實驗結束前停止供應飼料喂養12 h，稱重，作為實驗結束的最后體重。

1.5.2大鼠骨鈣、骨磷和羥脯氨酸含量的測定左側股骨精密稱重后，置于烤箱80℃烘烤72 h后至恒重，再次精密稱重。隨后將烘烤干的每份骨標本放入10 mL安培瓶中，加入5 mL 6 mol·L-1的HCL，酒精噴燈火燒密封安瓿瓶口后，再于108℃烤箱中消化24 h，之后取出過濾。取股骨原濾液0.25 mL，加入蒸餾水稀釋至5 mL，搖勻后為稀釋液。將骨稀釋液分為兩份：一份取骨稀釋液0.25 mL，加入蒸餾水稀釋至5 mL，用ICP儀檢測骨Ca、P的含量，再根據標準品含量和樣品稀釋倍數類計算Ca、P的含量；另一份取骨稀釋液1 mL，用羥脯氨酸測試盒中調pH值的乙液來調pH值到6～6.8，再加入蒸餾水稀釋至10 mL，之后按照測定試劑盒的方法，測定樣品的吸光度值，再根據公式計算羥脯氨酸含量。

1.5.3大鼠骨生物力學檢測方法[2]將-80℃保存的股骨常溫解凍，用酒精-生理鹽水復濕，用858 Mini Bionix型材料測試系統分析右側股骨的力學性能。把大鼠股骨放在MTS試驗機上，用加載速度為0.01 mm·s-1，跨距(L)為15 mm，直徑為1 mm的壓頭測試。試驗后，用游標卡尺測量股骨橫斷面的內外直徑。計算骨截面慣性矩，并繪制應力-應變曲線，得到最大載荷(maximum load)、剛度(stiffness)、最大強度(maximum strength)、斷裂強度(break strength)、彈性模量(elastic modulus)參數等。

1.5.4大鼠骨結構的Micro CT檢測及分析方法[3]將處理好的股骨下段放入Micro CT儀，對股骨近干骺端進行X-射線掃描。掃描條件為：電壓70 kVp，電流114 μA，掃描時間為24.8 min(單層)，間隔時間為200 ms，分辨率為中度(medium)。進行角度為180°的投射，對同一樣品掃描獲得500張不同截面的1024×1024像素的圖片，對于股骨選取距生長板遠端2 mm，層厚3 mm的骨組織為興趣區域(ROI)進行三維重建。完成圖像二值化，選定ROI內松質骨進行三維可視化呈現。定量分析使用其軟件(SCANCO Medical AG)，分析參數。參數包括骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨密度(BMD)、結構模型指數(SMI)、連接密度(Conn-Dens)以及各向異性的程度(DA)等。

2　結果

2.1各實驗組大鼠體重的變化如Tab 1所示，開始用藥前，大鼠體重各組間無統計學意義，各組大鼠體重隨著時間的推移而逐漸增加。實驗結束時，與CON組相比，OVX、MOD組的大鼠體重均明顯增加，分別增加10.83%、9.45%(P<0.01)。與MOD組相比，OVX、DES組體重差別無統計學意義，但RYR組的大鼠體重降低了14.29%(P<0.01)。RYR組的大鼠體重與DES組相比，差異具有統計學意義，RYR組降低了10.45%(P<0.01)。

2.2各實驗組大鼠骨成分的變化由Tab 2可知，與CON組相比，MOD組的股骨Ca、P、Hyp含量分別降低了12.90%(P<0.05)、12.50%(P<0.01)和9.26%(P<0.05)。而與MOD組相比，RYR組Ca和P含量均明顯增加，分別增加了18.52%和28.57%(P<0.01)。此外，與DES組相比，RYR組Ca和P含量明顯增加，分別增加了14.28%和28.57%(P<0.01)，提示去卵巢合并D-半乳糖可導致大鼠股骨骨礦物和膠原的丟失，紅曲膠囊可有效改善此種骨礦物質的丟失。

2.3各實驗組大鼠股骨生物力學的變化由Tab 3可知，MOD組股骨的生物力學性能指標均較CON組的呈下降趨勢，最大載荷、剛度、最大強度、斷裂強度、彈性模量，分別降低了8.14%(P<0.05)、14.36%(P<0.05)、16.10%(P<0.01)、15.06%(P<0.05)和16.10%(P<0.05)，且該組的斜型斷裂面明顯比CON組和藥物組大鼠要多，提示去卵巢合并D-半乳糖可明顯降低大鼠股骨的生物力學性能，容易發生骨折。與MOD組相比，兩個藥物的各個力學指標均有所增加：DES組中的最大載荷、剛度、最大強度分別增加了8.58%、14.27%和11.97%，差異具有統計學意義(P<0.05)；RYR組的最大載荷、剛度、最大強度、斷裂強度、彈性模量指標均有所增加，分別增加了3.49%、5.06%、10.92%、10.80%、3.90%，但差別無統計學意義。

2.4各實驗組大鼠股骨Micro CT指標的變化由Tab 4和Tab 5可知，與CON組相比，MOD組股骨Micro CT指標BV/TV、Tb.N、BMD、Conn-Dens均明顯降低，分別降低了72.10%、80.21%、68.45%和77.91%(P<0.01)，Tb.Sp、SMI均較CON組明顯增加，分別增加了440.91%和47.67%(P<0.01)，表明MOD組的大鼠股骨出現極明顯嚴重的結構退變，提示去卵巢合并D-半乳糖對大鼠股骨造成大量的骨丟失，表現出骨質疏松癥狀。與MOD組相比，OVX組的DA明顯降低，降低了5.92%(P<0.05)；DES組股骨的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD、Conn-Dens均明顯增加，分別增加了134.82%(P<0.01)、230.11%(P<0.01)、20.00%(P<0.05)、129.44(P<0.01)和168.03%(P<0.01)，Tb.Sp明顯降低了68.07%(P<0.01)；而RYR組股骨的各項指標趨勢與DES組相一致，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD、Conn-Dens均明顯增加，分別增加了346.49%、425.81%、60.00%、152.51和343.03%(P<0.01)，Tb.Sp和SMI均明顯降低，分別降低了82.35%和59.84%(P<0.01)。與DES組相比，RYR組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn-Dens明顯升高，分別增加了90.14%(P<0.01)、59.28%(P<0.01)、33.33%(P<0.05)、65.29(P<0.01)，Tb.Sp、SMI均明顯降低，分別降低了44.74%(P<0.05)、58.20%(P<0.01)，提示己烯雌酚與紅曲膠囊均可明顯增加股骨的骨量，改善骨小梁結構的退變。

Group0wk(g)2wk(g)4wk(g)6wk(g)8wk(g)CON230.53±16.32247.27±15.60260.01±13.76264.33±16.12257.12±15.16OVX232.40±23.32252.73±28.19265.25±27.38281.41±23.59284.97±23.34**MOD230.77±19.84255.77±18.41267.94±19.30277.40±19.68281.41±21.73**DES232.76±18.12242.80±13.11252.39±15.82263.22±17.29269.36±19.09RYR229.07±20.87214.92±15.55**##△△224.98±15.84**##△△236.67±14.38**##△△241.20±13.11##△△