茜草素激活Wistar大鼠腎葉間動脈平滑肌細胞大電導鈣激活鉀通道

何　瓊，王家寧，干艷捷，王元媛，張傳林

(湖北醫藥學院附屬人民醫院心臟中心，湖北 十堰　442000)

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茜草素激活Wistar大鼠腎葉間動脈平滑肌細胞大電導鈣激活鉀通道

何瓊，王家寧，干艷捷，王元媛，張傳林

(湖北醫藥學院附屬人民醫院心臟中心，湖北 十堰442000)

目的研究茜草素對大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium activated potassium channels,BKCa)的調節作用。方法在快速分離的Wistar大鼠腎葉間動脈平滑肌細胞上，應用膜片鉗技術研究茜草素對BKCa介導的外向電流的調節情況。結果BKCa特異性抑制劑伊比利亞毒素(ibTX)抑制茜草素的增強作用(P<0.01)；去除細胞外液中的鈣離子，L-鈣通道抑制劑尼莫地平(nimodipine)、鈣離子螯合劑BAPTA-AM和ryanodine均能抑制茜草素對腎葉間動脈平滑肌細胞外向電流的增強作用(P<0.05)。結論茜草素通過激活L-鈣通道，促進鈣離子由細胞膜外進入胞質，內流的鈣離子進一步激活ryanodine受體，引起胞質中鈣離子濃度快速升高，激活平滑肌細胞膜BKCa通道。

茜草素；膜片鉗；腎葉間動脈；BKCa通道；鈣離子；平滑肌

在腎葉間動脈平滑肌細胞膜上的BKCa激活后，介導細胞內鉀離子外流，導致細胞膜電位超極化，引起血管擴張[1]。但是高血壓狀態下，動脈平滑肌細胞膜BKCa功能和表達障礙致其介導的舒張血管功能減弱[2]，導致肌源緊張性高血壓的產生[3]。中藥茜草是治療高血壓的重要中藥材之一，研究發現茜草提純后的有效成分是1-2-二羥基-9-10-蒽二酮[4]，但是含有1-2-二羥基-9-10-蒽二酮的番瀉葉可以激活L型鈣離子通道，導致鈣離子由細胞膜外進入胞質[5]。在平滑肌細胞中，鈣離子內流可導致平滑肌細胞去極化，引起動脈血管收縮，這與茜草在中醫臨床治療高血壓相矛盾[6]。但是細胞內鈣離子濃度的變化是BKCa激活的重要條件。因此我們應用膜片鉗技術研究茜草素對大鼠腎葉間動脈及其平滑肌細胞BKCa介導的外向電流的調節機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物中心(許可證編號SCXK京2007-0001)，動物質量符合清潔級動物標準，10～12周齡，♀♂不拘，體質量(283.0±21.2)g。

1.2試驗藥物及主要試劑茜草素批號及規格：122777-100 g；使用二甲基亞砜(DMSO)將茜草素配置為10-2mol·L-1的母液，再使用預先配置的PSS液體稀釋。二甲基亞砜(DMSO)批號及規格：D2650-100 mL。BAPTA-AM批號及規格:A1076-25 mg；Ryanodine批號及規格:R128-25 mg；伊比利亞毒素(ibTX)批號及規格：15904-100 μg；均使用預先配置的PSS液體溶解。以上藥物均購自Sigma公司。配置PSS液體使用的試驗試劑均是國產分析純試劑，高效液相色譜法(HPLC)分析純度不小于97%，(2～8)℃保存。

1.3方法全細胞膜片鉗實驗方法參照王洋等[7]及李新芝等[8]方法。

2　結果

2.1ibTX抑制茜草素的增強作用細胞封接穩定后孵育30 s，平滑肌細胞外向電流(60 mV)是(258.0±8.5) pA， 給予10-5mol·L-1茜草素預灌流15 s后，外向電流是(354.0±11.4) pA，預灌流10-8mol·L-1ibTX 3 min，再給予10-5mol·L-1茜草素預灌流15 s，平滑肌細胞外向電流是(122.6±5.5) pA(n=6，P<0.01)，細胞外液洗脫3 min后外向電流是(243.0±8.8) pA，見Fig 1。

2.2細胞膜外鈣離子介導茜草素增強腎葉間動脈平滑肌細胞外向電流將腎葉間動脈平滑肌細胞在無鈣外液孵育30 min后，給予10-5mol·L-1茜草素預灌流15 s前后電流(60 mV)分別是：(65.3±9.4)pA和(64.8±8.1)pA，預灌流前后無統計學差異；含有鈣離子的細胞外液茜草素預灌流15 s前后電流(60 mV)分別是：(258±8.5)pA和(354±11.4)pA(n=6，P<0.01)，見Fig 2。

Fig 1　ibTX inhibits alizarin mediated outward currents(n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2　Ca2+ inhibits alizarin enhancing effect in extra-cellular fluid(n=6)

*P<0.05vscontrol

2.3尼莫地平抑制茜草素的增強作用預灌流尼莫地平(L-鈣通道抑制劑，10-5mol·L-1) 前后，給予茜草素(10-5mol·L-1)，腎葉間動脈平滑肌細胞外向電流(60 mV)分別是(551.0±71.0)pA和(54.1±11.0)pA (n=6，P<0.01)，見Fig 3。

2.4細胞內鈣離子介導茜草素增強的外向電流將BAPTA-AM(鈣離子螯合劑，20 μmol·L-1) 加入電極內液，待細胞封接穩定后孵育30 s，待細胞內離子螯合，再給予茜草素(10-5mol·L-1)預灌流15 s，預灌流前后腎葉間動脈平滑肌細胞的外向電流(60 mV)分別為(70.2±8.1)pA和(67.8±11.2)pA(n=6，P>0.05)，見Fig 4。

Fig 3　Nimodipine inhibits alizarin

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4　Ca2+ inhibits alizarin enhancing effect in intracellular fluid(n=6)

*P<0.05vscontrol

2.5ryanodine受體介導茜草素增強腎葉間動脈平滑肌細胞外向電流將ryanodine加入(ryanodine受體調節劑，10 μmol·L-1)電極內液，待細胞封接穩定后孵育30 s，再給予茜草素(10-5mol·L-1)預灌流15 s，預灌流前后腎葉間動脈平滑肌細胞的外向電流(60 mV)分別為(56.2±9.4)pA和(54.8±7.7)pA(n=6，P>0.05)，見Fig 5。

Fig 5　10 μmol·L-1 ryanodine inhibits alizarin mediated outward currents(n=6)

*P<0.05vscontrol

3　討論

茜草素舒張腎葉間動脈，增強其平滑肌細胞膜介導的外向電流，導致細胞膜超極化，從而引起腎葉間動脈舒張，特異性BKCa抑制劑伊比利亞毒素(ibTX)抑制茜草素的增強作用提示茜草素增強的腎葉間動脈平滑肌細胞膜外向電流由BKCa介導[9]。

有研究發現平滑肌細胞質內鈣離子濃度的升高是BKCa激活的重要條件[10]，去除細胞外液中的鈣離子，將消化分離的單個平滑肌在無鈣的細胞外液中孵育30 min，茜草素對腎葉間動脈平滑肌細胞的外向電流增加作用消失，間接提示茜草素增強BKCa介導的外向電流所需的鈣離子來源于細胞膜外。

L-鈣通道抑制劑尼莫地平(nimodipine)抑制茜草素增強的BKCa介導的外向電流提示細胞膜外的鈣離子通過激活L-鈣通道后進入細胞質內，這與Wu等[4]研究結果相一致。

有研究表明[12]，胞質中鈣離子濃度達到5 μmol·L-1時BKCa被激活。在電極內液中加入鈣離子螯合劑BAPTA-AM，茜草素對葉間動脈的增強作用被抑制，也提示細胞質中鈣離子濃度在激活BKCa中的重要作用。

Plüger等[13]研究發現平滑肌內肌漿網ryanodine受體被激活后，引起平滑肌細胞胞質中發生“鈣火花”，進一步激活其周圍的BKCa，我們在電極內液中加入ryanodine(選擇性ryanodine受體調節劑，10 μmol·L-1)，茜草素的增強作用被抑制，提示茜草素間接激活ryanodine受體[13]，引起細胞內鈣離子濃度升高，最終激活BKCa，引起鉀離子外流，平滑肌細胞超極化，腎葉間動脈血管舒張[9]。茜草素是否在平滑肌細胞內引起“鈣火花”，尚需進一步研究證實。

細胞質中鈣離子的升高有兩個途徑：細胞外流入和細胞內肌質網釋放[4,13]。在靜息狀態下，平滑肌細胞質內游離的鈣離子濃度是0.1 μmol·L-1，當肌細胞興奮出現后，胞質內鈣離子濃度快速上升至1～10 μmol·L-1[11]。即當細胞外鈣離子通過相應通道進入胞質后觸發“鈣內流激活鈣釋放”：即“細胞外鈣離子內流誘導細胞內肌質網釋放鈣離子進入胞質”[13]，胞質中快速升高的鈣離子濃度是平滑肌細胞收縮的重要條件，同時也是BKCa激活[12]的重要條件。因此，我們推測：平滑肌細胞興奮后，鈣離子由細胞外通過鈣通道進入細胞內，在鈣離子濃度尚未達到激活BKCa的條件下，平滑肌細胞發生收縮，但為了保持生理平衡，當鈣離子濃度達到5 μmol·L-1時，BKCa被激活[12]，鉀離子外流，平滑肌細胞復極化，血管舒張。

總之通過本研究發現：茜草素通過激活L-鈣通道，促使細胞膜外鈣離子進入胞質中，細胞外鈣離子內流，進一步激活肌漿網上ryanodine受體，導致內鈣釋放，可能導致胞質中產生 “鈣火花”，“ 鈣火花”附近BKCa被激活[13]，導致鉀離子外流，平滑肌細胞超極化，最終引起腎葉間動脈舒張。

[1]England S K, Wooldridge T A, Stekiel W J, et al. Enhanced single-channel K+currents in arterial membranes from genetically hypertensive rats[J].AmJPhysiol, 1993, 264: H1337-45.

[2]Nelson M T, Quayle J M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle[J].AmJPhysiol, 1995, 268:C799-822.

[3]羅興林, 何川, 楊艷, 等. 原發性高血壓患者血壓參數與血管平滑肌細胞鈣激活鉀通道活性的相關性研究[J]. 中國循環雜志, 2005, 2(20):126-9.

[3]Luo X L, He C, Yang Y,et al. Relationship of parameters of blood pressure and calcium activated potssium channels of Vessel smooth muscle in patienst with essential hypertension[J].ChinCirculJ, 2005, 2(20):126-9.

[4]Wu Z X, Yu B P, Xia H, Xu L. Emodin increases Ca(2+) influx through L-type Ca(2+) channel in guinea pig gallbladder smooth muscle[J].EurJPharmacol, 2008, 24(595):95-9.

[5]林秀珍, 靳珠華. 番瀉甙、大黃多糖和大黃素對腦細胞內游離鈣濃度的影響[J]. 藥學學報, 1995, 30:307-10.

[5]Lin X Z, Jin Z H. Effects of Sennosides, rhubarb polysaccharides and emodin on the cytoplasmic free cacium in isolated rat brain cells[J].ActaPharmSin, 1995, 30:307-10.

[6]周繼胡, 丁濤, 溫富春, 等. 鉤藤總生物堿膠囊降壓作用研究[J].長春中醫藥大學學報,2013,29(12):1117-8.

[6]Zhou J H, Ding T,Wen F C, et al. Antihypertensive effects of rhynchophylla total alkaloids capsules[J].JChangchunUnivTraditChinMed,2013,29(12):1117-8.

[7]王洋, 馬克濤, 張傳林, 等. 奎尼丁增強大鼠軟腦膜動脈平滑肌細胞BKCa通道介導的外向電流[J].中國藥理學通報,2013,29(4): 43-6.

[7]Wang Y, Ma K T, Zhang C L, et al. Quinidine enhance BKCachannel mediated outward current in pial artery smooth muscle cell of SD rat[J].ChinPharmacolBull,2013, 29(4): 43-6.

[8]李新芝, 司軍強, 張忠雙, 等. 急性缺氧增強豚鼠小腦前下動脈平滑肌細胞外向電流并抑制縫隙連接[J].生理學報,2011,63(6): 533-9.

[8]Li X Z, Si J Q, Zhang Z S, et al. Acute hypoxia increases outward current and decreases gap junction of VSMCs in guinea-pig inferior cerebellar artery[J].ActaPhysiolSin,2011, 63(6): 533-9.

[9]張傳林, 李曉雯, 何瓊, 等. 茜草素增強Wistar大鼠平滑肌細胞BKCa介導的外向電流舒張腎葉間動脈[J].中藥藥理與臨床,2016,32(1):33-5.

[9]Zhang C L, Li X W, He Q, et al. Alizarin enhanced BKCa-induced outward currents relaxed renal interlobar artery in Wistar rats[J].PharmacolClinChinMatMed,2016, 32(1):33-5.

[10]Wei A, Solaro C, Lingle C, et al. Calcium sensitivity of BK type KCachannels determined by a separable domain[J].Neuron, 1994, 13:671-81.

[11]姚泰, 曹濟民, 樊小力, 等. 生理學[M].第2版. 北京: 人民衛生出版社, 2010： 61.

[11]Yao T, Cao J M, Fan X L, et al.Physiology[M]. 2nd Edition. Beijing: People’s health publishing, 2010： 61.

[12]Gollasch H, Haller F C, Luft H, et al. Mice with disrupted BK channel beta1 subunit gene feature abnormal Ca2+spark/STOC coupling and elevated blood pressure[J].CircRes,2000,87: E53-E60.

[13]Plüger S, Faulhaber J, Fürstenau M, et al. Mice with disrupted BK channel beta1 subunit gene feature abnormal Ca(2+) spark/STOC coupling and elevated blood pressure[J].CircRes,2000, 87(11): E53-60.

Alizarin activates large-conductance Ca2+-activated K+channels on renal interlobar arterial vascular smooth muscle cells in Wistar rat

HE Qiong, WANG Jia-ning,GAN Yan-jie, WANG Yuan-yuan,ZHANG Chuan-lin

(HeartCenter,RenminHospital,HubeiUniversityofMedicine,ShiyanHubei442000,China)

AimTo investage the regulatory effect of alizarin on renal interlobar arterial smooth muscle cells.MethodThe effect of alizarin on BKCachannels was observed by whole-cell patch clamp recording technique.ResultsSelective BKCachannel blocker ibTX inhibited alizarin-induced outward current(P<0.05); single smooth muscle cells were incubated in extracellular fluid with no Ca2+30 minutes, selective L-Ca2+channel blocker nimodipine, selective calcium ion chelating agent BAPTA-AM and ryanodine inhibited the alizarin-induced BKCachannels current, too(P<0.05).ConclusionAlizarin relaxes renales interlobar arterial smooth muscle via activation of L-Ca2+channel firstly, which lead to Ca2+flowed into cytoplam, and rising of Ca2+in cytoplam ryanodine receptor indirectly, and BKCais activated at last.

alizarin; patch clamp recording; renal interlobar arterial; BKCa; Ca2+; smooth musclecell

2016-05-09,

2016-06-21

國家自然科學基金資助項目(No 81270221)；十堰市科技局項目(No 15Y34)

何瓊(1976-)，女，碩士，副主任醫師，研究方向：心臟電生理,E-mail:zcllovexq@126.com；

張傳林(1985-)，男，碩士，研究方向：心臟和血管電生理學，通訊作者，E-mail:drzhangchuanlin@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.015

A

1001-1978(2016)09-1264-04

R-332；R284. 1；R322. 74； R329.24

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.030.html