異可利定對大鼠心肌缺血及缺血/再灌注所致心律失常的影響

汪紅梅，馬云淑，黃秋艷，孔淑君，王　輝，鄧　林

(云南中醫學院中藥學院，云南 昆明　 650500)

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異可利定對大鼠心肌缺血及缺血/再灌注所致心律失常的影響

汪紅梅，馬云淑，黃秋艷，孔淑君，王輝，鄧林

(云南中醫學院中藥學院，云南 昆明 650500)

目的探究異可利定對大鼠心肌缺血及缺血/再灌注所致心律失常的影響。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、心肌缺血/再灌注模型組、陽性藥維拉帕米組、異可利定(2.5、5、10 mg·kg-1)組，共6組，每組16只。結扎大鼠左冠狀動脈建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，記錄Ⅱ導聯心電圖，并測定大鼠心肌缺血面積、心肌梗死范圍及心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等生化指標。結果異可利定可以明顯降低大鼠缺血/再灌注室性早搏(ventricular extrasystole，VE)、室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)、心室顫動(ventricular fibrillation，VF)的發生率；減少缺血期間大鼠心肌缺血面積和心肌梗死范圍；明顯升高缺血/再灌注損傷心肌SOD、GSH-Px的含量，降低MDA含量。結論異可利定對心臟缺血/再灌注損傷有保護作用，可能與其抗氧化作用有關。

異可利定；心律失常；心肌缺血/再灌注；心肌梗死范圍；大鼠；抗氧化

異可利定(isocorydine),亦名異紫堇定或異紫堇定堿，系自防己科千金藤屬植物白線薯(StephaniabrachyandraDiels)或頭花千金藤(StephaniacepharanthaHayats)的塊根經分離提取而得。是一種異喹啉類阿樸菲型(aporphine)生物堿，具有多種生理活性[1-2]。

冠心病、心肌梗死等常見疾病是由心肌缺血引起的，最有效的治療方法就是對缺血心肌進行再灌注，而再灌注可引起缺血/再灌注損傷。其中，再灌注心律失常是其主要表現之一[3]。心肌缺血后最有效的治療方式是恢復心肌血流灌注，但再灌注會導致可逆性缺血損傷加重，或使其轉化為不可逆性損傷，這種現象稱為心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。再灌注性心律失常(reperfusion arrhythmia，RA)是 MIRI中的一種主要表現形式。再灌注心律失常表現形式多樣，常見室性早搏(ventricular extrasystole，VE)、室性心動過速(ventricular tachycardia，VT)及心室顫動(ventricular fibrillation，VF)等快速心律失常，還有竇性心動過緩、房顫、房室傳導阻滯等慢性再灌注心律失常[4-5]。

前期實驗表明，異可利定靜脈注射對氯仿、烏頭堿、氯化鋇、氯化鈣及腎上腺素等引起的多種動物心律失常有效[6-7]。本實驗采用大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，旨在進一步觀察、研究異可利定對大鼠冠狀動脈結扎所致大鼠心律失常的作用及心肌缺血/再灌注損傷的保護作用，并初步探討其機制，為推廣應用提供科學依據。這一類生物堿所表現的生物活性與其結構密切相關，并且多種活性之間存在較好的相關性，深入開展其結構與活性之間、活性與活性之間的相關性研究，不僅對了解藥物作用機制、優化先導物結構、闡釋傳統中藥作用機制具有重要意義。且云南有豐富的山烏龜亞屬植物資源，能為研究提供種類豐富、數量充足的異喹啉類生物堿原料。

1　儀器與材料

1.1儀器動物呼吸機(HX-200，成都泰盟科技有限公司)；生物機能實驗系統(BL-420E，成都泰盟科技有限公司)；帶線縫合針(上海浦東金環醫療用品股份有限公司)；高速分散器(XHF-I，寧波新芝生物科技股份有限公司)；臺式離心機(TGL-16G，上海安亭科學儀器廠)；電子天平(SartoriusBT25S，賽多利斯科學儀器北京有限公司)；超聲機(SK250HP，上海科導超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9023A，上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑異可利定(純度為99.4%，實驗室自制)，鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號43150401)，水合氯醛(AR，天津市大茂化學試劑廠，批號20150715)，甲醛溶液(AR，四川西隴化工有限公司，批號141022)，TTC(Biosharp，批號T8877)，0.5%埃文斯藍染色液(北京索萊寶科技有限公司，批號20150908 )，SOD、MDA、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)，其余試劑均為分析純。

1.3動物SD大鼠，SPF級，♂，(220±30)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2011-0003。

2　方法

2.1動物分組及藥物處理取SD ♂健康大鼠96只，隨機分為假手術(sham operation，Sham)組、心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，I/R)模型組、陽性對照組鹽酸維拉帕米組、異可利定(2.5、5、10 mg·kg-1)組，共6組，每組16只。各組動物在結扎冠脈前3 min經股靜脈給予相應藥物，Sham組和心肌缺血/再灌注模型組給予生理鹽水注射[8-9]。

2.2大鼠在體心肌缺血/再灌注造模方法大鼠用100 g·L-1水合氯醛溶液(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉并固定。① 暴露氣管，氣管插管，用小動物呼吸機正壓通氣(潮氣量為每20～30 mL·kg-1，吸呼比2 ∶3，頻率70～75次/min)，記錄Ⅱ導聯ECG。② 經股靜脈給藥后3 min，沿胸骨左緣心臟搏動處縱行切開皮膚約2 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，胸前肌肉及筋膜3～4 cm，在心臟搏動最明顯處，于左側第四肋間，用止血鉗鈍性分離肋間肌長3 cm，打開胸腔，撐開第4和第5肋骨，輕輕剪開心包膜，用左手拇指及四指將心臟輕輕擠出胸腔。在左心耳下方2 mm處用眼科小圓針5/0絲線穿線，進針深度為1～1.5 mm，寬2～3 mm，連同心大靜脈一齊結扎冠狀動脈左前降支，打一個活結結扎。結扎冠狀動脈后，迅速將心臟放入胸腔，輕擠胸腔排出胸腔氣體，用止血鉗夾緊皮膚閉合胸腔，除Sham組大鼠只掛線不結扎外，其余各組均結扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending，LAD)[10-12]。15 min后松開LAD，再灌注30 min，結扎成功的標志是缺血區呈紫紺，心電圖示ST段抬高。冠狀動脈再通標志是缺血區轉紅，ST段降低。③制備心肌梗死范圍心臟標本：各組有一半動物在缺血/再灌注結束后，再次原位結扎LAD，經動脈導管推注質量分數為0.5%埃文斯藍染色液1 mL，待大鼠鞏膜藍染后迅速取出心臟，在冷生理鹽水(4 ℃)中沖洗，并剪去心房和右室游離壁，濾紙吸干水分，-20 ℃保存。④ 制備生化指標檢測心臟標本：各組另一半大鼠取出心臟后，迅速于冷生理鹽水中沖洗并剪去心耳、大血管，稱重后-20 ℃保存。

2.3心律失常評分方法觀察缺血/再灌注期間大鼠心電圖曲線(評判標準見Fig 1)，記錄VE出現次數，VT發生率及累積持續時間，VF發生率和持續時間。

Fig 1　Arrhythmia ECG

A:Normal ECG;B:VE;C:VT;D:VF;E:ST elevation

2.4心肌梗死范圍測定取冷凍(-20 ℃)心臟標本，沿左室長軸切成1.0 mm厚的薄片，置于質量分數為1%的TTC溶液中，37 ℃孵育20 min，然后用體積分數為10的甲醛溶液固定。藍色心肌為非缺血心肌組織，粉色為缺血但未壞死心肌組織，蒼白色為缺血壞死心肌組織。吸干水分后，用解剖刀剔去不同顏色心肌組織(評判標準見Fig 2)，分別稱重，并按公式計算心肌缺血范圍(ischemic zone size)和心肌梗死范圍(infarction size)。

心肌缺血范圍和心肌梗死范圍的重量比率計算公式：

心肌缺血范圍/%=(紅色+蒼白色)/左室×100%

心肌梗死范圍/%=蒼白色/(紅色+蒼白色)×100%

Fig 2　Dyeing myocardial ischemia

2.5心肌組織生化指標測定用勻漿機將心臟制0.25 kg·L-1心肌組織生理鹽水勻漿，測定SOD、MDA、GSH-Px等生化指標，測定方法按試劑盒說明進行。

Tab 1　Effect of isocorydine on arrhythmia of myocardial ischemia/reperfusion in ±s，n=16)

*P<0.05，**P<0.01vsI/R

3　結果

3.1異可利定對大鼠心肌缺血及再灌注心律失常的影響缺血及再灌注期間，與I/R組比較，維拉帕米組降低VT發生率及VF發生率，且能明顯地推遲心律失常發生的時間，縮短心律失常持續的時間，差異具有統計學意義(P<0.05)。異可利定各劑量組均能不同程度降低VT發生率及VF發生率，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；且能明顯地推遲結扎冠狀大鼠室性心律失常發生的時間，縮短心律失常持續的時間，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，且異可利定中劑量組比維拉帕米組有好的趨勢。但是都對VE作用不明顯，結扎大鼠冠狀動脈左前降支后大約3 min，易出現室性心律失常。見Tab 1。

3.2異可利定對大鼠心肌缺血面積和心肌梗死范圍的影響假手術組無心肌缺血及心肌梗死現象，與I/R組比較，維拉帕米組與異可利定各劑量組均能不同程度降低缺血及再灌注期間大鼠心肌缺血范圍，明顯減少缺血期間大鼠心肌梗死范圍，差異具有統計意義(P<0.05，P<0.01 )。見Tab 2。

GroupDose/mg·kg-1Ischemiczone/%Infarctionsize/%Sham-00I/R-66.63±7.5734.86±5.95Verapamil2.552.17±7.52*19.00±13.34*Isocorydine2.553.39±11.98*19.52±6.20*5.055.19±5.39*26.84±8.2910.053.29±8.46**19.08±12.32*

*P<0.05，**P<0.01vsI/R

3.3異可利定對大鼠缺血/再灌注心肌SOD、MDA、GSH-Px等生化指標的影響與Sham組比較，I/R組心肌組織SOD、GSH-Px活性明顯下降，而脂質過氧化代謝產物MDA含量明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。與I/R組比較，異可利定各劑量組與維拉帕米組均能不同程度升高心肌組織SOD、GSH-Px活性，而降低脂質過氧化代謝產物MDA含量，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。見Tab 3。

GroupDose/mg·kg-1SOD/kU·g-1ProGSH-Px/kU·g-1ProMDA/μmol·g-1ProSham-264.65±61.62567.73±49.652.00±0.36I/R-147.15±32.76##344.19±101.60##3.09±0.70##Verapamil2.5191.18±58.45*424.69±23.372.22±0.34*Isocorydine2.5220.87±34.80**496.91±63.54*2.41±0.14*5.0176.92±31.63506.03±99.46*2.11±0.33**10.0169.77±28.92497.25±87.14*2.54±0.29*

*P<0.05，**P<0.01vsI/R；##P<0.01vssham

4　討論

心肌缺血/再灌注損傷過程中，由于產生大量的氧自由基和細胞內Ca2+超載，從而使清除氧自由基的酶，SOD活性及GSH-Px活性降低，導致氧自由基的堆積，膜脂質過氧化物產物MDA含量增多，加重了心肌細胞的傷害，造成膜生物電不穩定性[13-14]。實驗表明，異可利定能明顯地推遲缺血/再灌注心律失常發生的時間，并縮短心律失常的持續時間，還能降低室性VE、VT及VF的發生率，使心肌組織中SOD活性及GSH-Px活性明顯升高，降低膜脂質過氧化物產物MDA含量，與I/R組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。在抑制大鼠缺血/再灌注誘發心律失常的發生率，減輕再灌注造成的心肌損傷同時，還能降低心肌缺血面積及梗死范圍，其機制可能與抗氧自由基與增加內源性氧自由基清除力，減輕脂質過氧化，維持細胞膜的正常通透性，減少酶的釋放有關，從而達到抗心律失常，保護心肌損傷的效應。

綜上所述，異可利定可抑制氧自由基介導的心肌細胞膜損害，穩定細胞膜的完整性，阻止細胞內、外離子分布異常，穩定心肌細胞的自律性，從而達到保護心肌、穩定心律、降低再灌注性心律失常的作用。

今后還可以繼續研究該類生物堿變化多樣的結構與活性，研究該類生物堿的抗心律失常作用構效關系，對先導化合物進行結構修飾等研究。尋找高效、低毒并具有多通道阻滯機制的藥物，不僅符合目前抗心律失常藥物的研究方向，也是中藥現代化、國際化的研究方向，即對已知活性的天然產物進行結構修飾，開發尋找新藥。

(致謝：本實驗在云南中醫學院藥劑實驗室完成，衷心感謝機能實驗室楊瑜青老師的幫助與支持，感謝實驗室同學們的幫助和鼓勵！)

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Effect of isocorydine on arrhythmia in rats induced by myocardial ischemia/reperfusion injury

WANG Hong-mei, MA Yun-shu, HUANG Qiu-yan, KONG Shu-jun, WANG Hui, DENG Lin

(SchoolofChineseMateriaMedica,YunnanUniversityofTCM，Kunming650500,China)

AimTo investigate the effect of isocorydine on arrhythmia in rats induced by myocardial ischemia/reperfusion injury.MethodsSD rats were randomly divided into 6 groups: sham group, myocardial ischemia/reperfusion group, verapamil group and isocorydine group of 2.5, 5, 10 mg·kg-1, each group having 16 rats. Left anterior descending(LAD) was tied up to establish the injury model of myocardial ischemia. ECG was recorded for analysis. The ischemic and infarction area was measured and indexes of SOD, MDA, GSH-Px in the myocardial were determined.ResultsIsocorydine could significantly reduce the incidence of arrhythmia induced by ischemic/reperfusion, including VT, VF; and reduce ischemic and infarction area. Further study demonstrated that isocorydine could increase myocardial SOD and GSH-Px, but decrease myocardial MDA.ConclusionIsocorydine has a protective effect on the myocardial ischemia/reperfusion injury, which might be related to its anti-oxidative function.

isocorydine; arrhythmia; myocardial ischemia/reperfusion injury; ischemic and infarction area; rats; anti-oxidation

2016-04-29，

2016-05-30

國家自然科學基金資助項目(No 81260651)

汪紅梅(1989-)，女，碩士生，研究方向：藥物創新制劑研究與開發，E-mail：1191535827@qq.com；

馬云淑(1966-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：新型給藥系統，通訊作者，E-mail：yunshuma2@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.016

A

1001-1978(2016)09-1268-05

R-332；R284.1；R322.11；R541.7；R542.2；R972

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.032.html