EGCG通過miR-33a上調ABCA1表達減少巨噬細胞脂質蓄積

楊紅霞，高　亞，蔣恒波，劉錄山

(1.湖南永州職業技術學院，湖南 永州　425000；2 南華大學心血管疾病研究所，湖南 衡陽　421001)

?

EGCG通過miR-33a上調ABCA1表達減少巨噬細胞脂質蓄積

楊紅霞1，高亞2，蔣恒波1，劉錄山2

(1.湖南永州職業技術學院，湖南 永州425000；2 南華大學心血管疾病研究所，湖南 衡陽421001)

目的研究EGCG是否通過影響miR-33a的表達，進而調控ABCA1表達，促進巨噬細胞內膽固醇流出。方法先建立THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞，然后用EGCG處理，Real time PCR檢測細胞miR-33a表達。細胞隨機分為3組：空白對照組、50 μmol·L-1EGCG處理組、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，Real time PCR和Werstern blot檢測細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達，油紅O 染色和高效液相色譜法檢測細胞內脂質含量，[3H]法檢測細胞內膽固醇流出。結果在不影響細胞活性狀況下，EGCG呈濃度和時間依賴性下調miRNA33a表達；EGCG能明顯上調ABCA1 mRNA 和蛋白的表達，但能被轉染miRNA33 mimic抑制；EGCG可減少THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞中的脂質蓄積，但能被細胞中轉染miRNA33 mimic所弱化；EGCG減少細胞內膽固醇蓄積是與其促進細胞內膽固醇流出有關，細胞中轉入過量miRNA33a可以抑制膽固醇流出。結論EGCG可通過減少miRNA33a的生成，進而上調ABCA1表達，促進巨噬細胞中膽固醇流出，這可能是EGCG抗動脈粥樣硬化作用的分子機制之一。

三磷酸腺苷結合盒A1；小分子RNA；巨噬細胞；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；泡沫細胞；脂質代謝

MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA，主要通過與靶標基因的3′非翻譯區(3′UTR)靶向結合，直接降解靶基因的mRNA或抑制蛋白質翻譯而調控基因的表達。目前，miRNAs在脂質代謝中的調節作用日益得到重視，miR-33a位于固醇調節元件結合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2)基因的第16位內含子中，在哺乳動物體內高度保守，其主要靶基因是三磷酸腺苷結合盒A1(ATP binding cassette transporter A1， ABCA1)[1]。ABCA1是介導細胞膽固醇流出的主要膜轉運體，研究表明，miR-33a可抑制ABCA1表達，減少細胞內膽固醇流出，導致泡沫細胞的形成[1-2]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶中的一種主要活性成分，對動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤[3]等多種疾病均具有明顯的藥理作用。研究表明，EGCG可通過調節脂質代謝而抑制動脈粥樣硬化的發展[4-5]。近來研究也發現EGCG可上調巨噬細胞ABCA1表達抑制泡沫細胞形成[6]，但miR-33a是否在其中發揮作用尚不清楚。因此，本研究觀察EGCG是否影響THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞miR-33a的表達，并探討miR-33a在EGCG上調巨噬細胞ABCA1表達抑制泡沫細胞形成中的作用，從而為動脈粥樣硬化的防治提供新的策略。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑THP-1細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心； miR-33a 模擬物(miR-33a mimic)購自廣州銳博公司；EGCG、ABCA1 兔抗人一抗以及佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma 公司；GAPDH和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自杭州賢致公司；總RNA 抽提試劑盒購自Invitrogen 公司，SYBR Master Mixture購自TAKARA公司，RNA 逆轉錄試劑盒購自Promega 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、Western blot 熒光檢測試劑盒為江蘇碧云天公司產品，oxLDL購自廣州奕源生物科技有限公司，其余試劑為國產或進口分析純。

1.2細胞培養THP-1細胞160 nmol·L-1的PMA處理24 h，使其誘導分化為巨噬細胞，再用50 mg·L-1oxLDL孵育使其變成泡沫細胞作為實驗模型。THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞換無血清培養基培養后加按照實驗設計加處理因素。

1.3Real time PCR檢測細胞miR-33a表達用不同濃度EGCG(0、12.5、25、50 μmol·L-1)處理THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞24 h，或用50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞不同時間(0、6、12、24 h)，提取細胞RNA。miR-33a檢測引物由廣州銳博設計合成，上游引物為: 5′-GUGCAUUGUAGUUGCAUUG-3′，下游引物miScript 通用引物。 PCR條件為: 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環，設U6為內參，其相對表達量采用△△CT法計算。

1.4Real time PCR檢測細胞ABCA1 mRNA表達細胞隨機分為3組：空白對照組、50 μmol·L-1EGCG處理組、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，處理24 h后，提取細胞RNA。ABCA1上游引物為: 5′-GGTTTG GAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′, 下游引物為： 5′-CCCGGAAACGCAAGTCC-3′。采用SYBR綠色熒光檢測試劑盒進行Real time PCR分析。β-actin的表達用做內參照，其相對表達量采用△△CT 法計算。

1.5Werstern blot檢測細胞ABCA1 蛋白表達細胞分3組同1.4，處理24 h后收集細胞，加入裂解液，冰浴中放置30 min，4℃離心10 min，收集上清液備用。上清液中按4 ∶1加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃孵育10 min。10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，12 V恒壓半干轉膜40 min后，麗春紅染色5 min觀察轉膜情況。5%脫脂牛奶封閉2 h，按1 ∶ 500加入兔抗人ABCA1 一抗，4℃孵育12 h，TBST 洗3次，1 ∶1 000加入辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，用Tanon 5500免疫熒光檢測系統激發熒光，Tanon軟件攝取圖像并分析結果。

1.6油紅O染色檢測細胞內脂質含量取出預置蓋玻片，PBS液洗滌3次，用4%多聚甲醛固定10 min，油紅O染液染色10 min，再用蘇木精染色5 min，10 mL·L-1HCl分色及返藍，雙蒸水沖洗后甘油明膠封片。倒置顯微鏡下觀察，可見細胞內脂質呈紅染，細胞核呈藍染。

1.7高效液相色譜法檢測細胞內膽固醇含量參照文獻方法，收集細胞，加入生理鹽水200 μL，冰浴中超聲破碎細胞，用BCA 法測定蛋白含量后，加入三氯乙酸(6%)沉淀并去除蛋白，取上清進行膽固醇檢測。取100 μL上清液，加入氫氧化鉀溶液(8.9 mol/L) 200 μL，水解膽固醇酯后作為細胞內總膽固醇待測樣品。將樣品分別與內標液(豆甾醇)混勻，在用正己烷 ∶異丙醇(3 ∶2 ,V/V)溶液和無水乙醇抽提后真空干燥。上樣前用100 μL乙晴-異丙醇(70 ∶30，V/V) 溶解樣品，采用C-18 柱，溫度為室溫，流速1 mL·min-1，檢測波長為250 nm，以峰面積定量膽固醇，內標校準，以mg·g-1細胞蛋白為單位。

1.8[3H]法檢測細胞內膽固醇流出細胞先在正常培養液中和7.4 μGBq×103/L[3H]膽固醇共同孵育24 h，用PBS液洗滌細胞后置含脂蛋白的無血清培養液中再培養24 h。PBS 液漂洗細胞3次，加入閃爍液裂解細胞，用液閃計數法檢測培養液和細胞中的[3H]膽固醇含量。膽固醇流出率=培養液中cpm+總cpm(培養液cpm+細胞cpm)×100%。

2　結果

2.1EGCG對THP-1巨噬細胞毒性的觀察分別用0、12.5、25、50、100 μmol·L-1的EGCG處理THP-1 巨噬細胞24 h。采用MTT法檢測細胞活力，結果顯示，與0 μmol·L-1EGCG處理組相比，12.5～100 μmol·L-1EGCG各處理組細胞活力無明顯差異(Fig 1)，表明100 μmol·L-1濃度內的EGCG對THP-1巨噬細胞沒有明顯毒性。本研究后續實驗中采用12.5、25、50 μmol·L-1的EGCG作為細胞處理濃度。

Fig 1　Influence of different concentrations of EGCG on THP-1 macrophage viability after treatment 24 hours

2.2EGCG 對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞miR-33a表達的影響0、12.5、25、50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞24 h，Real time PCR檢測結果顯示，25、50 μmol ·L-1的EGCG處理后，細胞中miR-33a表達均下調(P<0.05)，50 μmol·L-1EGCG處理組下調最為明顯(Fig 2)。隨后，用50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞不同時間，Real time PCR檢測結果顯示，與0 h組相比，處理12 h組細胞miR-33a表達出現下調(P<0.05)，處理24 h組細胞miR-33a表達下調更為明顯(Fig 3)。

Fig 2　Influence of different concentrations of EGCG on miR-33a expression of THP-1

*P<0.05vs0 μmol·L-1EGCG treatment group

Fig 3　Influence of 50 μmol·L-1 EGCG on miR-33a expression of THP-1 macrophage-derived foam cells in different time point

*P<0.05vs0 h treatment group

2.3miR-33a在EGCG上調THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞ABCA1表達中的作用細胞隨機分為3組：空白對照組、50 μmol·L-1EGCG處理、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，處理24 h后，分別提取細胞RNA和蛋白質，采用Real time PCR以及Western blot檢測。Fig 4和Fig 5結果顯示，與空白對照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理組細胞ABCA1 mRNA和蛋白質均明顯上調(P<0.05)；而50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組與50 μmol·L-1EGCG單獨處理組相比，細胞ABCA1 mRNA和蛋白質均明顯下調(P<0.05)。這提示使THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞miR-33a過表達后，EGCG 上調細胞ABCA1表達的作用被明顯抑制。

Fig 4　Influence of miR-33a on EGCG increasing ABCA1 mRNA expression of THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

Fig 5　Influence of miR-33a on EGCG increasing ABCA1 protein expression of THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

2.4miR-33a在EGCG減少THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞脂質蓄積中的作用油紅O結果顯示，與空白對照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理組細胞內紅色脂滴明顯減少，而加入80 nmol·L-1miR-33a mimic共同處理后，細胞內的紅色脂滴又明顯增多(Fig 6)。HPLC檢測結果顯示，與空白對照組比較，50 μmol·L-1EGCG處理組細胞內總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯均明顯減少；而50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組與50 μmol·L-1EGCG單獨處理組相比，細胞內總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯的含量則明顯增加(Tab 1)。

Tab 1　Influence of miR-33a on EGCG reducing cholesterol content within THP-1 macrophage-derived foam cells(n=3)

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

Fig 6　Influence of miR-33a on EGCG reducing lipid droplets impact within THP-1 macrophage-derived foam cells

A:Control;B:EGCG;C:EGCG+miR-33a

2.5miR-33a在EGCG促THP-1巨噬細胞源性泡沫膽固醇流出中的作用Fig 7結果顯示，與空白對照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理使細胞膽固醇流出明顯增加(P<0.05)。而加入80 nmol·L-1miR-33a mimic共同處理細胞后，EGCG促膽固醇流出作用被明顯抑制(P<0.05)。

Fig 7　Influence of miR-33a on EGCG promoting cholesterol efflux from THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

3　討論

綠茶是中國傳統的保健養生飲品，茶多酚是綠茶中最主要的生物活性成分，主要由兒茶素、花色素、黃酮類和酚酸類4種物質組成[7]。EGCG是茶葉中含量最多的兒茶素，具有多種藥理學作用，其中就包括抗動脈粥樣硬化作用。EGCG抗動脈粥樣硬化作用的主要機制包括[7-8]：在腸道內和膽固醇形成沉淀物，并抑制腸道內酶的作用，二者共同降低腸道膽固醇的吸收；具有較強的抗低密度脂蛋白氧化作用，而氧化低密度脂蛋白是促使動脈粥樣硬化發生的關鍵因素。最近有研究[6]報道EGCG還可以上調巨噬細胞ABCA1的表達促進細胞內膽固醇流出，抑制巨噬細胞源性泡沫細胞形成，有可能是EGCG抗動脈粥樣硬化的一個新機制。但EGCG調節ABCA1表達的分子機制有待進一步闡釋。

miRNA與mRNA結合后誘導后者降解是新發現的一種調節基因表達的重要分子機制，miRNA介導的基因表達是機體內一個廣泛存在的基因表達調控方式，涉及到諸多生理過程和病理過程。其中miRNA調節脂質代謝相關基因表達是目前脂質代謝研究領域的一個熱點。目前已知參與脂質代謝基因表達調控的miRNAs包括miR-33、miR-122、miR-27a、miR-27b、miR-144和miR-370等，靶基因包括ABCA1、NPC1、ABCG1、SREBP和PPARγ等[9]。其中miRNA33通過調控ABCA1表達，影響膽固醇逆向轉運在脂質代謝中發揮重要作用。

miRNA在調節別的基因表達的同時，其自身的產生也受到內源性和外源性因素的調控。近來，一些天然化合物如姜黃素、白藜蘆醇、異黃酮、番茄素和EGCG等[10]被報道能夠調節miRNAs的表達。其中包括EGCG通過調節miRNA16進而調節Bcl-1抑制細胞凋亡，但未見EGCG對miRNA33a表達調節的報道，EGCG是否是通過調控miRNA 33a，進而調節ABCA1表達發揮抗動脈粥樣硬化作用呢？

我們的研究表明，在不影響細胞活性狀況下，EGCG呈濃度和時間依賴性下調miRNA33a表達，EGCG能明顯上調ABCA1 mRNA 和蛋白的表達，且這種上調作用能被過表達miRNA33a所弱化，表明EGCG確實可通過抑制miRNA33a的生成上調ABCA1表達。進一步的研究證實，EGCG可減少THP-1 巨噬細胞源性泡沫細胞中的脂質蓄積，且這種作用也可被細胞中轉入過量miRNA33a所弱化。細胞內膽固醇流出實驗證明，EGCG減少細胞內膽固醇蓄積是與其促進細胞內膽固醇流出有關，細胞中轉入過量miRNA33a可以抑制膽固醇流出。這和上述的EGCG促進了細胞內膽固醇流出關鍵蛋白ABCA1表達相一致。

綜上所述，我們的研究結果發現，EGCG是通過減少miRNA33a的生成，進而上調ABCA1表達，促進巨噬細胞中膽固醇流出，這可能是EGCG抗動脈粥樣硬化作用的分子機制。但很顯然，EGCG是否還可以通過調節其它miRNAs的表達，進而調節ABCA1表達，影響巨噬細胞膽固醇代謝有待進一步研究。

(致謝:本文部分工作在南華大學心血管疾病研究所完成，特此感謝！)

[1]Rayner K J, Suarez Y, Davalos A, et al. MiR-33 contributes to the regulation of cholesterol homeostasis[J].Science,2010, 328(5985): 1570-3.

[2]Mao M, Lei H, Liu Q, et al. Effects of miR-33a-5P on ABCA1/G1-mediated cholesterol efflux under inflammatory stress in THP-1 macrophages[J].PLoSOne，2014, 9(10):e109722.

[3]魏芳，劉浩，張配，等.EGCG對三陰乳腺癌細胞MDA-MB231的增殖抑制作用及機制[J].中國藥理學通報，2013，29(5)：280-4.

[3]Wei F，Liu H，Zhang P, et al. The inhibitory action of EGCG on the proliferation in the triple-negative breast cancer cell MDA-MB231 and its mechanism[J].ChinPharmacolBull, 2013 , 29(5):280-4.

[4]Hong Z, Xu Y, Yin J F, et al. Improving the effectiveness of (-)-epigallocatechin gallate(EGCG) against rabbit atherosclerosis by EGCG-loaded nanoparticles prepared from chitosan and polyaspartic acid[J].JAgricFoodChem,2014，62(52):12603-9.

[5]Xu X, Pan J, Zhou X.Amelioration of lipid profile and level of antioxidant activities by epigallocatechin-gallate in a rat model of atherogenesis[J].HeartLungCirc,2014,23(12):1194-201.

[6]Jiang J, Mo Z C, Yin K, et al. Epigallocatechin-3-gallate prevents TNF-α-induced NF-κB activation thereby upregulating ABCA1 via the Nrf2/Keap1 pathway in macrophage foam cells[J].IntJMolMed,2012,29(5):946-56.

[7]葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)生物活性研究進展[J].安徽農業大學學報，2011，38(2)：156-63.

[7]Ge J, Lin F, Li M K, et al. Research progress on biological activity of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)[J].JAnhuiAgricUniver, 2011,38(2):156-63.

[8]唐偉軍，陳美芳，江俊麟，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對低密度脂蛋白誘導的血管內皮損傷的保護作用[J].中國動脈硬化雜志，2006，14(1)：21-4.

[8]Tang W J, Chen M F, Jiang J L, et al. Epigallocatechin gallate preventing low density lipoprotein-induced endothelial dysfunction[J].ChinJArterioscler, 2006,14(1):21-4.

[9]Novák J,Bienertová-Va?kü J,Kára T,NoVák M.MicroRNAs involved in the lipid metabolism and their possible implications for atherosclerosis development and treatment[J].MediatorsInflamm,2014,2014:275867.

[10]Li Y, Kong D, Wang Z, et al. Regulation of microRNAs by natural agents: an emerging field in chemoprevention and chemotherapy research[J].PharmRes,2010;27(6):1027-41.

EGCG upregulated ABCA1 expression by decreasing miR-33a generation to reduce lipid accumulation of macrophage-derived foam cells

YANG Hong-xia1，GAO Ya2, JIANG Heng-bo1,Liu Lu-shan2

(1.HunanYongzhouVocationalTechnicalCollege，YongzhouHunan425000,China;2.InstituteofCardiovascularDiseases,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

AimTo investigate whether EGCG regulates ABCA1 expression by influencing the expression of miR-33a to promote cholesterol efflux from macrophages.MethodsTHP-1 macrophage-derived foam cells were established by co-incubated with oxLDL, and then treated with EGCG, and miR-33a expression was detected with Real-time PCR. THP-1 macrophage-derived foam cells were randomly divided into the following groups: control group, 50 μmol·L-1EGCG treatment group, 50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic treated group. Real-time PCR and Werstern blot was used to detect ABCA1 mRNA and protein expression, Oil Red O staining and high performance liquid chromatography were used to detect intracellular lipid content, and [3H] assay was used to determine cellular cholesterol efflux.ResultsEGCG could downregulate miRNA33a expression in a dose-and time-dependent fashion within safe doses. EGCG significantly upregulated ABCA1 mRNA and protein expression, which could be inhibited after miRNA33 mimic transfected into cells, however. EGCG may reduce lipid accumulation in THP-1 macrophage-derived

ABCA1; microRNA; macrophage; EGCG; foam cell; lipid metabolism

2016-04-10,

2016-06-12

生物流變科學與技術教育部重點實驗室開放基金課題(No CQKLBST-2014-002)

楊紅霞(1980-)，女，碩士，副教授，研究方向:心血管藥理，E-mail:13574696288@163.com;

高亞(1990-)，女，碩士生，研究方向:心血管疾病發病機制與防治;

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.018

A

1001-1978(2016)09-1279-06

R282.71；R329.24；R342.22；R344.81；R543.5

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.036.html

劉錄山(1974-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向:心血管疾病發病機制與防治，E-mail:liuls2000@163.com

foam cells, and this effect could also be weakened after miRNA33 mimic transfected. EGCG could reduce the accumulation of intracellular cholesterol,which was related with EGCG promoting intracellular cholesterol efflux, and excess miRNA33a transfected into cells could inhibit intracellular cholesterol efflux.ConclusionEGCG may upregulate ABCA1 expression by reducing miRNA33a generation, resulting in the promotion of cholesterol efflux from macrophages, which may be one of the molecular mechanisms of EGCG anti-atherosclerotic effect.