耐吉非替尼的HCC827GR細胞的高效誘導及其藥理學特性

鐘　磊，師健友

(電子科技大學附屬醫院，四川省人民醫院，個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都　610072)

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耐吉非替尼的HCC827GR細胞的高效誘導及其藥理學特性

鐘磊，師健友

(電子科技大學附屬醫院，四川省人民醫院，個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都610072)

目的建立對吉非替尼(gefitinib)耐受的NSCLC細胞株，并觀察其藥理學特性。方法采用HGF和濃度遞增的gefitinib處理HCC827細胞以誘導細胞耐藥；MTT法測試細胞活力和藥物敏感性；克隆形成和Edu染色驗證gefitinib對細胞的生長抑制作用；qRT-PCR和Western blot實驗檢測細胞中c-Met表達。結果HGF的使用可縮短HCC827GR耐藥細胞的誘導時間；gefitinib可明顯抑制HCC827親本細胞的細胞活力、克隆形成和細胞增殖，而對HCC827GR細胞的生長抑制作用很弱；HCC827GR細胞c-Met高表達，對c-Met抑制劑高度敏感。結論成功并高效誘導了對gefitinib耐藥的HCC827GR細胞，該細胞生長依賴c-Met蛋白活性，對c-Met抑制劑較敏感，可作為c-Met抑制劑的表型篩選模型。

非小細胞肺癌；吉非替尼；c-Met；耐藥；表型篩選；激酶抑制劑

吉非替尼(gefitinib)是第1代EGFR抑制劑，它對具有 EGFR 19 位外顯子E746-A750缺失突變和21位外顯子L858R點突變這兩種敏感突變，以及 EGFR 擴增的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者具有較好的療效，是治療這類患者的常規用藥[1]。然而，大部分使用gefitinib的患者在用藥后會產生耐受，其中，約20%的患者耐藥的原因是c-Met基因擴增[2]。

c-Met是一種原癌基因，c-Met蛋白是肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的唯一已知受體，它除了可導致抗腫瘤藥物耐藥以外，與腫瘤的進展、轉移，以及腫瘤干細胞的自更新也密切相關，被認為是有效的腫瘤治療靶點[3-5]。因此，建立一種c-Met過表達、且生長高度依賴c-Met蛋白活性的細胞株，無論是在相關的耐藥和轉移機制的研究，還是在以c-Met為靶點的藥物篩選和發現中均有十分重要的用途。本研究即以NSCLC細胞株HCC827為親本細胞，采用gefitinib和HGF共同處理此細胞，快速誘導產生了c-Met高表達的對gefitinib耐受的HCC827GR細胞，并對其藥理學特性進行了探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞和試劑NSCLC細胞株購自美國模式培養物集存庫(ATCC)；HGF購自美國Peprotech公司；RPMI 1640培養基、胰酶、DMSO、MTT和結晶紫均購自Sigma公司；胎牛血清購自草原綠野生物工程材料有限公司；p-Met Tyr1234/1235和c-Met抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin和辣根過氧化酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RIPA裂解液、G250蛋白定量試劑和蛋白酶抑制劑均購自Roche公司；Edu增殖檢測試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；cDNA合成試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購自美國BIO-RAD公司；gefitinib、Crizotinib、PHA-665752和PF-04217903等藥物購自美國Selleck公司。

1.1.2主要儀器BHC-1000IIA/B3型生物安全柜，蘇凈安泰生物技術有限公司；IX50型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Heraeus BB15型細胞培養箱、Multiscan MK3酶標儀、Sorvall ST16型低速離心機，美國Thermo Fisher公司；JY300C型電泳儀，北京君意東方電泳儀器有限公司；ABI7500型熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

1.2方法

1.2.1HCC827GR細胞的誘導向生長狀態良好且處于對數生長期的HCC827細胞中加入50 μg·L-1HGF和0.1 μmol·L-1gefitinib，隨后，每3 d更換1次含細胞因子和藥物的培養基，待細胞對該濃度藥物耐受后再依次將藥物濃度提升至0.2、0.5、1和10 μmol·L-1，且當藥物濃度增加至1 μmol·L-1時不再添加HGF。在藥物處理過程中，細胞長滿后正常傳代，細胞貼壁后再加藥處理。以此法處理細胞4周左右即可得到對gefitinib耐受的HCC827GR細胞。

1.2.2MTT細胞活力檢測收集對數生長期的HCC827和HCC827GR細胞，每孔接種6 000個細胞，接種體積100 μL。次日，采用不同濃度的藥物處理細胞，每個濃度3個復孔，并設置溶劑對照組。藥物處理72 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，在37 ℃孵育2～4 h，再加入50 μL質量濃度為200 g·L-1的酸性SDS溶液，于37 ℃溶解甲臜過夜，最后采用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光度值，并用Graphpad Prism軟件分析測試結果，繪制細胞存活率-濃度曲線。

1.2.3克隆形成實驗收集對數生長期的HCC827和HCC827GR細胞，以每孔2 000個細胞的量接種于6孔板中。次日細胞貼壁后，向每孔加入不同濃度的gefitinib處理細胞，并設置溶劑對照組。此后，每3 d更換1次含藥培養基，連續作用12 d后，棄去培養基，用甲醇固定細胞，并用2.5 g·L-1的結晶紫染液對細胞克隆進行染色并拍照。

1.2.4Edu細胞增殖檢測收集對數生長期的HCC827和HCC827GR細胞，以每孔8 000個細胞的量接種于96孔板中，次日細胞貼壁后，向每孔加入適宜濃度的gefitinib，作用24 h，再進行Edu細胞增殖檢測，檢測方法按照Cell-LightTMEdu Apollo 567InVitroKit(廣州銳博生物)說明書進行。

1.2.5實時熒光定量PCR收集HCC827和HCC827GR細胞，按試劑盒操作說明提取兩種細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA，再進行熒光定量PCR檢測c-Met表達。使用的引物序列如下：c-Met(forward)：5′-GAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′，c-Met(reverse)：5′-GATGATTCCCTCGGTCAGAA -3′；GAPDH(forward)：5′-CAGGTGGTCTCCTCTGACTT -3′，GAPDH(reverse)：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCA-3′。

按以下參數進行熒光定量PCR反應：95℃×30 s → 95℃×5 s，60℃×30 s(35個循環)→ 95℃×5 s。以GAPDH mRNA表達水平作為內參，通過檢測目的基因相對于內參基因的表達變化來定量。1.2.6Western blot實驗收集HCC827和HCC827GR等NSCLC細胞，裂解，超聲，提取總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉至PVDF膜，使用質量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉2 h，再分別加入1 ∶1 000稀釋的p-Met、c-Met或β-actin抗體，于4 ℃孵育過夜。次日，再加入1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，在37 ℃ 孵育1 h，隨后用TBS/T洗脫除去過量抗體，在暗室中加入顯影液顯影曝光。

2　結果

2.1HCC827GR耐藥細胞的驗證

2.1.1gefitinib對HCC827和HCC827GR細胞活力的影響我們采用MTT法對HCC827GR的耐藥性進行了檢測，并以HCC827親本細胞作為對照，結果顯示，gefitinib對19位外顯子E746-A750缺失突變的HCC827親本細胞的IC50值為(2.3±0.16)nmol·L-1，而對HCC827GR細胞的IC50值為(12.4±0.48)μmol·L-1(Fig 1A)，兩者相差約5 000倍，表明HCC827GR細胞對gefitinib產生了耐受。

2.1.2gefitinib對HCC827和HCC827GR克隆形成的影響我們進一步采用克隆形成實驗檢測了gefitinib對HCC827和HCC827GR細胞的生長抑制作用，結果如Fig 1B所示，gefitinib在1 μmol·L-1濃度時幾乎已完全抑制了HCC827細胞的克隆形成，但是對HCC827GR的生長無影響，且在10 μmol·L-1濃度時，gefitinib也未能完全抑制HCC827GR細胞形成細胞克隆。

2.1.3gefitinib對HCC827和HCC827GR細胞增殖的影響Edu細胞增殖檢測的實驗結果如Fig 1C顯示，Edu(紅色熒光)標記增殖的細胞，Hochest(藍色熒光)標記腫瘤細胞核，在1 μmol·L-1濃度時，gefitinib可有效抑制HCC827細胞的增殖，而對HCC827GR細胞增殖無影響，gefitinib對兩種細胞的增殖抑制作用差異有顯著性。

Fig 1　Growth inhibition of gefitinib against HCC827 and HCC827GR cells

A:Cells were treated with gefitinib or vehicle for 72 h, and cell viability was determined by MTT assay;B:Cells were treated with gefitinib or vehicle for 12 days, and clonies were stained with crystal violet and photographed;C:Cells were treated with gefitinib for 24 h, followed by Edu cell incorporation assay.**P<0.01vsVehicle

2.1.4HCC827和HCC827GR細胞中c-Met表達水平對比為驗證HCC827GR是否具有c-Met基因擴增的特性，我們對兩種細胞的c-Met表達水平進行了對比研究。RT-PCR的實驗結果顯示，HCC827GR細胞中c-Met mRNA表達水平明顯高于HCC827細胞(Fig 2A)。Western blot的實驗結果進一步證明，在蛋白水平上，HCC827GR細胞中總c-Met和活性c-Met的表達也明顯高于HCC827親本細胞(Fig 2B)，表明誘導產生的HCC827GR細胞c-Met高表達。

2.2HCC827GR細胞對c-Met抑制劑的敏感性研究

Fig 2　c-Met expression in HCC827 and HCC827GR cells

A:c-Met mRNA expression was determined by quantitative RT-PCR;B:Expression of c-Met protein was determined by Western blot.**P<0.01vsHCC827

2.2.1NSCLC細胞中c-Met表達水平對比我們收集了6種NSCLC細胞株，并對其c-Met蛋白表達水平進行了檢測。結果如Fig 3所示，A549、Calu6和H1975 3種細胞中c-Met表達水平較低；H1993和H441是已知的NSCLC細胞中c-Met高表達的細胞[6]，它們的c-Met蛋白表達量較上述3種細胞略高；而HCC827GR細胞的c-Met表達水平又明顯高于H1993和H441。

Fig 3　Expression level of c-Met protein in several NSCLC cells

2.2.23種NSCLC細胞對c-Met抑制劑的敏感度對比研究我們進一步采用c-Met抑制劑crizotinib、PHA-665752和PF-04217903處理c-Met表達水平較高的3種細胞HCC827GR、H1993和H441，以評估它們對c-Met抑制劑的敏感性。結果顯示，藥物對細胞的生長抑制作用與細胞中c-Met表達水平有較高的相關性，c-Met表達量越高的細胞，藥物對其抑制作用越明顯，3種細胞中HCC827GR c-Met表達水平較高，對3種c-Met抑制劑均更為敏感(Fig 4)。

Fig 4　Sensitivity of HCC827GR, H1993 and H441 to c-Met inhibitors

3　討論

HCC827細胞是具有EGFR 19位外顯子E746-A750缺失突變的NSCLC細胞，對gefitinib高度敏感，采用常規的濃度遞增式誘導方法，要獲得對gefitinib耐受的HCC827GR細胞，需要約6個月時間[7-8]。而本研究在誘導過程中加入了HGF，使耐藥細胞的誘導時間縮短至1個月，其理論依據即在于，HCC827細胞本身就含有少量c-Met基因擴增的細胞克隆[7]。采用gefitinib和HGF共同處理的方法，一方面大量殺滅了敏感細胞，另一方面刺激了c-Met基因擴增的細胞克隆快速增殖，從而達到高效篩選并富集這類耐藥克隆的目的。采用此種方法誘導產生的HCC827GR細胞與文獻報道的單純采用gefitinib誘導的耐藥細胞一樣，細胞活力、克隆形成和細胞增殖不再受gefitinib影響，且在撤掉HGF以后傳代數次，耐藥性仍持續存在。進一步的基因和蛋白水平的檢測結果證實，HCC827GR細胞中c-Met高表達。

基于靶點的篩選和基于表型的篩選是新藥研發常用的研究手段，前者通過靶點甄選和針對該靶點的酶水平測試篩選藥物，得到的化合物往往達不到預期的療效；后者利用疾病相關表型直接篩選，得到的化合物有效率高，但是在藥物靶點鑒定和作用機制研究中難度較大。本研究中我們成功誘導了c-Met高表達的HCC827GR細胞，該細胞生長依賴于c-Met活性，對c-Met抑制劑高度敏感。采用該細胞進行藥物篩選，比一般的表型篩選模型更具優勢，可通過觀察細胞活力這一表型直接篩選到潛在的c-Met抑制劑，在c-Met抑制劑篩選和藥物靶點鑒定中具有重要用途。

綜上所述，本研究高效誘導了對gefitinib耐受的HCC827GR細胞，該細胞生長高度依賴于c-Met蛋白活性，對c-Met抑制劑敏感，可作為c-Met抑制劑的表型篩選模型。

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Efficient induction of gefitinib-resistant cell line HCC827GR and its pharmacological properties

ZHONG Lei，SHI Jian-you

(HospitalofUniversityofElectronicScienceandTechnologyofChinaandSichuanProvincialPeople’sHospital,PersonalizedDrugTherapyKeyLaboratoryofSichuanProvince,Chengdu610072,China)

AimTo establish a gefitinib-resistant NSCLC cell line, and observe its pharmacological properties.MethodsHCC827 cells were treated with hepatocyte growth factor(HGF) and increasing concentration of gefitinib to induce cell resistance. MTT assay was used to test cell viability and chemosensitivity. Clone formation and Edu staining were used to verify the inhibitory effect of gefitinib on cell growth. qRT-PCR and Western blot were used to assay the expression of c-Met. ResultsThe use of HGF greatly shortened the induction time of HCC827GR resistant cells. gefitinib could significantly suppress cell viability, colony formation and cell proliferation of HCC827, but had a weaker inhibitory effect on HCC827GR cells. HCC827GR overexpressed c-Met protein, and was highly sensitive to c-Met inhibitors.ConclusionThe gefitinib-resistant HCC827GR cells were induced successfully and efficiently. The growth of HCC827GR is dependent on the activity of c-Met protein, and it can be used as a phenotypic screening model of c-Met inhibitors.

non-small cell lung cancer；gefitinib；Met；drug resistance；phenotypic screening；kinase inhibitor

2016-04-18,

2016-05-23

國家自然科學基金資助項目(No 81302643)

鐘磊(1985-)，男，博士，助理研究員，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail：zhl7235301@163.com；

師健友(1981-)，男，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向：藥物化學，通訊作者，E-mail：shijianyou2010@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.019

A

1001-1978(2016)09-1284-05

R329.24；R394.2；R734.2；R965.1；R979.1

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.038.html