黃芪甲苷保護大鼠缺血/再灌注心臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制研究

賀永貴，張義東，張國彬，王　培，付　宇，習瑾昆，鄭　桓

(華北理工大學1.附屬醫(yī)院；2.心臟研究所，中匈合作中醫(yī)藥實驗室，唐山市新藥基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 唐山　063000)

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黃芪甲苷保護大鼠缺血/再灌注心臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制研究

賀永貴1，張義東2，張國彬2，王培2，付宇2，習瑾昆2，鄭桓2

(華北理工大學1.附屬醫(yī)院；2.心臟研究所，中匈合作中醫(yī)藥實驗室，唐山市新藥基礎(chǔ)研究重點實驗室，河北 唐山063000)

目的研究黃芪甲苷保護缺血/再灌注心臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)機制。方法建立離體心臟缺血/再灌注模型，♂ Wistar大鼠結(jié)扎冠狀動脈進行心肌缺血30 min/再灌注120 min，隨機分成假手術(shù)組、缺血/再灌注組、ERS抑制劑?；切苊撗跄懰?TUDCA)組、黃芪甲苷組；Western blot檢測缺血期及再灌注期ERS分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的表達；激光掃描共聚焦顯微鏡免疫熒光化學染色法檢測GRP78的表達；TTC法測定心肌梗死面積；HE染色觀察心肌組織形態(tài)學改變。結(jié)果與假手術(shù)組相比，缺血期GRP78表達沒有明顯增加，再灌注期GRP78表達明顯增加，黃芪甲苷能夠模擬TUDCA明顯抑制再灌注期GRP78的表達、減少心肌梗死面積、改善心肌組織的形態(tài)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論ERS發(fā)生于再灌注期而不是缺血期，黃芪甲苷通過抑制ERS保護大鼠缺血/再灌注心臟。

黃芪甲苷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；缺血/再灌注損傷；?；切苊撗跄懰?；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是威脅人類健康的重要疾病，早期再灌注治療雖然可以減少心肌梗死面積、改善臨床預后，但是缺血心肌血流恢復卻可能引起更為嚴重的心肌再灌注損傷(myocardial reperfusion injury, MRI)[1]。傳統(tǒng)中藥黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)的心肌保護作用歷史久遠[2]，有報道顯示，黃芪甲苷可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)機制抑制炎癥、減少凋亡，參與糖尿病腎病腎臟的保護作用[3-4]，但ERS與心肌保護的研究較少。本研究通過大鼠心臟缺血/再灌注損傷模型，觀察ERS發(fā)生的具體時間，探討黃芪甲苷是否通過ERS機制保護再灌注心臟，為黃芪甲苷的心肌保護作用機制提供可靠實驗依據(jù)，為AMI新藥研發(fā)提供新思路。

1　材料

1.1動物實驗用♂ Wistar大鼠，體質(zhì)量250～350 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(冀)2010-0038。

1.2主要材料與試劑黃芪甲苷購自天津馬克生物技術(shù)有限公司(批號：HQJG-20110507)。ERS抑制劑TUDCA購自Sigma-aldrich 公司。GRP78抗體、β-Tubulin抗體購自美國Cell signaling technology公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、BCA試劑盒、ECL試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3儀器Langendorff體外心臟灌流系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(成都儀器廠)；電泳儀(Invitrogen公司)；550型酶標儀、Trans-Blot SD干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；生物圖像采集系統(tǒng)(美國UVP公司)；FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

2　方法

2.1實驗分組及動物模型制備

2.1.1實驗分組健康♂ Wistar大鼠，隨機分為假手術(shù)組、缺血/再灌注組、ERS抑制劑TUDCA組、黃芪甲苷組。

2.1.2動物模型制備Lengandorff系統(tǒng)建立大鼠心肌缺血/再灌注模型。將♂ Wistar大鼠(250～350 g)用苯巴比妥鈉(100 mg·kg-1)及肝素(2 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，開胸取心臟，立即放入預冷生理鹽水平皿內(nèi)，沖掉殘留血液，迅速懸掛于Langendorff 灌流裝置上，行主動脈逆行灌流(Kerbs-Henseleit 緩沖液)。灌注穩(wěn)定20 min后，用5-0絲線穿于冠狀動脈周圍，以造成局部缺血。再灌注時，松開小止血鉗即可。

2.2Werstern blot檢測GRP78蛋白表達提取心肌組織總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。以60 μg蛋白上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。10%脫脂牛奶室溫封閉30～60 min，GRP78抗體(1 ∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。二抗(1 ∶1 000稀釋)室溫孵育1 h后，ECL熒光顯色。用β-Tubulin進行內(nèi)參檢測。將X光片用Mixrotek Scan Wizard掃描軟件進行電腦掃描，Image J圖像分析軟件對條帶進行灰度掃描及定量分析。

2.3免疫熒光化學染色法檢測GRP78蛋白表達制備心肌組織切片，60℃～62℃烤箱中烘烤30～60 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。滴加0.3%～0.5% H2O2室溫10 min，PBS洗滌。枸櫞酸鈉高壓修復90 s，PBS洗滌。滴加正常血清室溫封閉20 min，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜。次日用PBS洗滌，滴加熒光二抗，濕盒內(nèi)室溫60 min，滴加PI染液，濕盒內(nèi)室溫15 min，PBS洗滌。用PBS以1 ∶3比例稀釋甘油后封片，共聚焦顯微鏡觀察并拍片。

2.4心肌梗死面積測定再灌注120 min時，永久性結(jié)扎冠狀動脈，由主動脈逆行注入高分子熒光微球以區(qū)分梗死區(qū)。心臟稱重，在-70℃冰箱凍存1～2 h。取出冷凍的心臟，從心尖至心底沿心臟橫軸快速切成1 mm的心臟組織切片，游離出每個左心室組織切片，置于1% TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，恒溫37℃孵育20 min后，浸入10%的福爾馬林溶液，以提高染色和非染色組織的對比度。此時可見紅色為非心肌梗死區(qū)，灰白色不著色組織為心肌梗死區(qū)。將心臟組織切片放在兩塊玻璃板中間并壓平，紫外光下描出標本和缺血區(qū)輪廓，觀察梗死面積。梗死區(qū)和危險區(qū)繪圖于透明塑料膜上，用Image Tool軟件量化。梗死面積(% )=梗死區(qū)/危險區(qū)×100%

2.5HE染色觀察形態(tài)學改變心肌組織于4% 福爾馬林溶液中固定24 h，流動水沖洗12～24 h。依次入梯度酒精、醇苯混合液、二甲苯，觀察至充分透明。將放有標本的包埋框放在液態(tài)石蠟中放(60～62)℃烤箱中過夜。蠟塊整修，組織膜放在45℃的水中展開，用多聚賴氨酸載玻片撈片，烤箱中(溫度在63℃以下)烘烤至少12 h。60℃～62℃烘烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度酒精及水化，放入蘇木素染色，水洗。鹽酸酒精分化10～30 s，用1%氨水藍化10 s，水洗。放入伊紅染色30 s，依次梯度酒精脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片。

2.6實驗步驟離體心臟灌流，穩(wěn)定20 min，缺血30 min，再灌注120 min。取左心室危險區(qū)組織進行指標檢測。分別取缺血期10、30 min及再灌注30、60 min的心肌組織進行GRP78蛋白檢測，以觀察缺血及再灌注對ERS的影響。取再灌注30 min的心肌組織，以觀察黃芪甲苷對再灌注誘導的ERS的影響。再灌注120 min測量心肌梗死面積。

3　結(jié)果

3.1心臟缺血/再灌注對ERS的影響在缺血30 min過程中，GRP78與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計學意義(Fig 1)。而在再灌注不同時間點，缺血/再灌注組的GRP78表達較假手術(shù)組明顯加強(P<0.05)(Fig 2)，提示ERS發(fā)生于再灌注期而不是缺血期。

Fig 1　GRP78 expression during ischemia

GRP78 expression did not increase during ischemia in isolated rat hearts

3.2黃芪甲苷對缺血/再灌注心臟ERS的影響與假手術(shù)組相比，缺血/再灌注組的GRP78表達明顯增加，黃芪甲苷能夠模擬ERS抑制劑TUDCA明顯減少再灌注引起的GRP78表達(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 2　GRP78 expression during reperfusion

GRP78 expression significantly increased during reperfusion in isolated rat hearts.*P<0.05vssham

Fig 3　Effect of Astragaloside Ⅳ on GRP78 expression in ischemia/reperfusion hearts

I/R significantly increased GRP78 expression compared to sham, Astragaloside Ⅳ given at reperfusion could mimic TUDCA and significantly reduced GRP78 expression in isolated rat hearts.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.A:Sham;B:I/R;C:TUDCA;D:Ast-Ⅳ

3.3黃芪甲苷對GRP78熒光的影響如Fig 4所示，與假手術(shù)組相比，缺血/再灌注組GRP78綠色熒光表達明顯增加，黃芪甲苷能夠模擬TUDCA明顯減少GRP78的綠色熒光表達(見Fig 4)。

Fig 4　Immunofluorescence image with confocal microscopy of effect of Astragaloside Ⅳ on GRP78 fluorescent intensity(Scale bar, 20 μm)

I/R significantly increased GRP78 fluorescent intensity compared to sham, Astragaloside Ⅳ given at reperfusion could mimic TUDCA and markedly reduced GRP78 fluorescent intensity in isolated rat hearts, indicating that Astragaloside Ⅳ can protect the heart against reperfusion injury through the inhibition of ERS. A:Sham; B:I/R; C:TUDCA; D:Ast-IV

3.4黃芪甲苷對心肌梗死面積的影響與缺血/再灌注組相比，黃芪甲苷能夠模擬TUDCA明顯減少心肌梗死面積，提示抑制 ERS可能是黃芪甲苷保護再灌注心臟的機制之一(Fig 5)。

3.5黃芪甲苷對再灌注心肌組織形態(tài)學的影響正常心肌纖維染色為粉紅色，胞質(zhì)和胞核清晰可見，纖維排列整齊，無變性壞死，無炎細胞浸潤。缺血/再灌注組心肌纖維間隙增寬，排列紊亂、斷裂。給予黃芪甲苷和TUDCA后，心肌纖維排列較整齊，斷裂較少，間隙稍有增寬(Fig 6)。

4　討論

黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)是中藥黃芪的重要活性成分，具有強大的心肌保護作用[2,5]，我們的前期研究也證實，黃芪甲苷通過使糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)失活進而抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mPTP)開放，發(fā)揮再灌注心肌保護作用[2,6]。但是黃芪甲苷的心肌保護作用的詳細細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制尚不明確，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)機制研究較少。

Fig 5　Effect of Astragaloside Ⅳ on infarct size

Astragaloside Ⅳ given at reperfusion could mimic TUDCA and significantly reduced myocardial infarct size in isolated rat hearts, indicating that Astragaloside Ⅳ can protect the heart against reperfusion injury through the inhibition of ERS.*P<0.05vscontrol

Fig 6　HE staining of effect of Astragaloside Ⅳ on morphology in isolated rat hearts(Scale bar,50 μm)

A:Sham; B:I/R; C:TUDCA; D:Ast-IV

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的細胞器，主要參與蛋白合成、折疊和修飾，調(diào)控脂質(zhì)和膽固醇代謝、鈣穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡和自噬等，在細胞的生命活動中具有重要意義[7-8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實現(xiàn)其功能的基本條件，內(nèi)環(huán)境失衡例如缺血/再灌注、氧化應激、自由基蓄積、鈣失衡等可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，導致ERS。持續(xù)的ERS可進一步誘導基因轉(zhuǎn)錄水平上的核應激和代謝水平上的線粒體應激。ERS的早期主要是ERS伴侶分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、GRP94等表達上調(diào)。而當細胞損傷嚴重時，ERS相關(guān)凋亡信號途徑活化，表現(xiàn)為CHOP、JNK和caspase-12及其級聯(lián)反應的活化[9-10]。ERS參與多種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性病變、免疫反應[11]。本研究通過Lengandorff系統(tǒng)建立大鼠離體心臟缺血/再灌注模型，觀察ERS與心肌缺血/再灌注的關(guān)系，探討黃芪甲苷是否通過ERS途徑保護再灌注心臟。

為了探討缺血/再灌注是否引起ERS，我們制備大鼠心肌缺血/再灌注模型，分別檢測缺血期及再灌注期ERS標志蛋白GRP78的表達。結(jié)果顯示，在缺血30 min過程中，GRP78表達未見明顯增加，而在再灌注期不同時間點GRP78表達明顯增加，提示ERS發(fā)生于再灌注期而不是缺血期。

為了探討黃芪甲苷對再灌注誘發(fā)的ERS的影響，在再灌注期給予ERS抑制劑TUDCA及黃芪甲苷，結(jié)果顯示，黃芪甲苷能夠模擬TUDCA，明顯減少再灌注時GRP78的表達，說明黃芪甲苷能夠減少再灌注誘發(fā)的ERS。黃芪甲苷和TUDCA均能減少心肌梗死面積，說明ERS在心肌再灌注損傷中起有害作用，抑制ERS可能是黃芪甲苷保護再灌注心臟的有效方法。共聚焦顯微鏡免疫熒光化學染色觀察GRP78綠色熒光表達，與Western結(jié)果相一致，進一步證明黃芪甲苷通過抑制ERS而保護缺血/再灌注心臟。

通過HE染色觀察心肌纖維的形態(tài)學改變結(jié)果顯示，正常心肌纖維染色呈粉紅色，細胞質(zhì)和細胞核清晰可見，心肌纖維排列整齊，無變形及壞死，無炎細胞浸潤。與正常心肌組織相比，缺血/再灌注心肌組織肌纖維間隙增寬，排列紊亂、斷裂。給予黃芪甲苷和TUDCA后，心肌纖維排列較整齊，斷裂較少，間隙稍有增寬。此結(jié)果說明ERS可能是黃芪甲苷保護缺血/再灌注心臟的重要機制之一。

本實驗結(jié)果顯示，GRP78在缺血期沒有明顯增加，而在再灌注期表達明顯增加，黃芪甲苷能夠模擬TUDCA抑制再灌注期GRP78的表達，減少心肌梗死面積。以上研究結(jié)果提示，ERS發(fā)生于再灌注期而不是缺血期，黃芪甲苷通過抑制ERS保護大鼠缺血/再灌注心臟。

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Role of ERS in Astragaloside Ⅳ-induced cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in rats

HE Yong-gui1, ZHANG Yi-dong2, ZHANG Guo-bin2, WANG Pei2, FU Yu2, XI Jin-kun2, ZHENG Huan2

(1.AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology;2.MedicalResearchCenterofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Chinese-Hungarian

CooperationChineseMedicalLaboratory,TangshanKeyLaboratoryofDrugResearch,TangshanHebei063000,China)

AimTo explore the role of endoplasmic reticulum stress(ERS) in Astragaloside Ⅳ-induced cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in rats.MethodsA model of myocardial ischemia 30 min followed by 120 min reperfusion was made by ligating coronary artery in male Wistar rats. Rats were divided randomly into 4 groups: sham group, ischemia/reperfusion group, ERS inhibitor TUDCA group, Astragaloside Ⅳ group. Myocardial samples were collected from the risk zones during ischemia and reperfusion, ERS was determined by measuring levels of glucose regulated protein 78(GRP78), an established marker of ERS with Western blot. Immunofluorescence study was used to test GRP78 intensity with laser scanning confocal microscopy, TTC method was used to measure the infarct size，hematoxylin-eosin staining was used to observe the changes of morphological changes of myocardium.ResultsThere was no statistical difference in GRP78 expression during ischemia compared to the sham group, but was markedly increased upon reperfusion. Astragaloside Ⅳ could mimic TUDCA and significantly decreased the GRP78 expression, reduced infarct size and improved the morphology of myocardial tissue with a significant statistical difference compared with the control group(P<0.05).ConclusionsERS is induced upon reperfusion but not during ischemia in isolated rat hearts. Astragaloside Ⅳ prevents myocardial reperfusion injury presumably by the inhibition of ERS.

Astragaloside IV; endoplasmic reticulum stress; ischemia/reperfusion injury; TUDCA; GRP 78

2016-05-17,

2016-06-25

國家自然科學基金資助項目(No 81570275)；河北省高等學?？茖W技術(shù)研究項目(No ZD2014006, QN2014092)；河北省中醫(yī)藥管理局項目(No 2014196)；河北省衛(wèi)生廳科研項目(No 20150080)；華北理工大學杰出青年基金(No JP201302)

賀永貴(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：心腦血管藥理學，E-mail：heyonggui@163.com；

習瑾昆(1975-)，女，博士，教授，碩士生導師；

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.020

A

1001-1978(2016)09-1289-05

R-332；R284.1；R322.11；R542.220.22；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.040.html

鄭桓(1968-)，男，副教授，研究方向：心肌保護機制，通訊作者，E-mail：jinkunxi@126.com