壬苯醇醚-9誘導小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型的建立

黃　超, 弓藝涓, 田　芳, 王玉柱, 孫　冰,2, 夏敏杰, 職瑞娜,2, 丁訓誠, 周新初, 李衛華（. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 20002；2. 復旦大學公共衛生學院, 上海 20002； . 上海交通大學農業與生物學院, 上海, 200）

·論著·

壬苯醇醚-9誘導小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型的建立

黃超1, 弓藝涓1, 田芳1, 王玉柱1, 孫冰1,2, 夏敏杰1, 職瑞娜1,2, 丁訓誠1, 周新初3, 李衛華1
（1. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 200032；2. 復旦大學公共衛生學院, 上海 200032； 3. 上海交通大學農業與生物學院, 上海, 201101）

目的探索建立廣西巴馬小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型的方法。方法將6只雌性小型豬隨機分為基質對照組和壬苯醇醚-9（N-9）模型組（40 mg/mL）（每組3只）。肌肉注射苯甲酸雌二醇12 d后，各組陰道給藥5 mL/d，連續7 d。造模后取陰道黏膜組織進行病理檢查，并根據上皮潰瘍、壞死、細胞浸潤、出血、充血、水腫等指標進行病理評分； 造模后24 h與72 h，采集陰道灌流液（CVL）, 采用流式細胞術對CVL沉淀細胞中的中性粒細胞比例和CD45+細胞百分率進行分析； 免疫組織化學法（IHC）檢測陰道黏膜組織中CD45+細胞的表達及分布。結果組織病理學觀察顯示，N-9模型組陰道黏膜上皮損傷明顯，出現不同程度的潰瘍、壞死、炎性浸潤、出血、水腫等。病理評分結果顯示，N-9模型組病理總分值（18.0±3.2）與基質對照組（3.3±0.2）相比明顯升高（P＜0.01）。N-9 模型組CVL的中性粒細胞比例為41.70%±1.63% （24 h）和51.17%±3.81% （72 h）， CD45+細胞比例為58.5%±4.73%（24 h）和88.0%±3.57 %（72 h），與基質對照組相比均顯著增高（P＜0.01）。N-9模型組陰道黏膜CD45+細胞表達明顯增多，累積光密度值為33.95± 6.69，顯著高于基質對照組（23.42±3.30）（P＜0.05）。結論陰道連續給予N-9凝膠7 d可以誘發小型豬陰道黏膜明顯的炎性反應，符合陰道黏膜免疫炎癥反應模型的特征。

小型豬； 壬苯醇醚-9（N-9）； 病理組織學； 陰道灌流液（CVL）； 免疫炎癥反應；白細胞共同抗原CD45

美國食品藥品監督管理局（FDA）推薦的家兔陰道刺激性模型（RVI）是評價陰道外用藥物的局部黏膜刺激性的經典模型［1］。然而, 隨著抗人類免疫缺陷病毒（HIV）陰道殺微生物劑的研發, 對陰道外用藥物的臨床前安全性評價指標提出了新的要求, 需要特別關注陰道黏膜炎癥因子和免疫細胞的活化情況［2］。因此亟需探索更為適宜的用于評價陰道黏膜炎癥反應的動物模型［3］。

目前，評價抗HIV陰道殺微生物劑的動物模型主要有三類： 小鼠單純皰疹2病毒（HSV-2）感染模型［4］、家兔陰道刺激性模型［5］和非人靈長類模型。Patton等［6］利用非人靈長類模型對28種候選陰道殺微生物劑進行了安全性評價。考慮到非人靈長類動物昂貴的價格和有限的資源, 除猴模型外, 國外有報道采用小型豬模型代替短尾猴模型來評價候選藥物對陰道黏膜的促炎癥作用，檢測陰道免疫細胞活化狀態和細胞因子釋放［7,8］。由于小型豬和人類的生殖道在組織學、亞細胞結構甚至滲透性方面都非常相似, 有望成為一種陰道免疫炎癥評價模型［9］。

壬苯醇醚-9（N-9）是一種非離子型表面活性劑,是目前使用最普遍的一種外用殺精子藥物。本研究選擇廣西巴馬小型豬作為陰道黏膜免疫炎癥反應研究的實驗動物, 經陰道連續給予N-9（200 mg/d）7 d 后, 觀察小型豬陰道組織病理損傷、陰道粘膜炎性細胞數目以及免疫細胞活化程度的變化, 探討N-9誘導小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型的特征。

1　材料與方法

1.1實驗動物、試劑與主要儀器

普通級成年雌性廣西巴馬小型豬6只, 35～40 kg,購自上海浦東新區華新物種實驗動物養殖場［SCXK滬）2012-0013］。飼養于上海交通大學普通級動物房［SYXK（滬）2011-0128］，溫度22～28 ℃, 12 h/12 h明暗周期； 動物食用標準顆粒飼料，自由飲水［動物實驗倫理審查編號： 2013-26］。

N-9膠凍劑40 mg/g（中國藥科大學制藥有限公司，國藥準字H10930102）； 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業股份有限公司）； 兔抗豬CD45多抗抗體美國Abcame公司）； FITC標記的CD45單克隆抗體美國BD公司）； SA1022-兔IgG 鏈霉親和素生物素過氧化物酶復合物（SABC）免疫組織化學染色試劑盒［帶二氨基聯苯胺（DAB）顯色液］（武漢博士德生物公司）； BA1003抗體（武漢博士德生物公司）。

FACS Calibur型熒光分選細胞儀, FORTESSA型流式細胞儀（美國BD公司）； Olympus BX43型生物顯微鏡（日本Olympus公司）； Leica RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）。

1.2模型制備及動物分組

雌性小型豬6只, 購入后適應環境10 d, 根據本課題組有關黏膜刺激性試驗的分組及給藥量要求, 按體質量隨機分成2組： 基質對照組（給予無藥熱敏凝膠5 mL/d）； N-9 模型組（200 mg/d）, 每組3只。給藥前所有小型豬肌肉注射苯甲酸雌二醇400 μg/kg，肌肉注射后的12 d開始陰道給藥（以小型豬的發情期約8～10 d推算）5 mL/d，連續給藥7 d。末次給藥后72 h處死動物取陰道黏膜進行HE染色檢查評分,按照D’Cruz等［10］的方法, 采用基質對照組的平均分值 （）和標準差（s）95%參考值（±1.64 s）作為判定該藥是否可被臨床接受的標準, 確定造模是否成功。

1.3陰道黏膜組織病理學檢查

末次給藥72 h后處死，解剖取完整陰道組織，縱向切開，肉眼觀察是否充血，水腫等異常表現，然后用體積分數10%中性緩沖甲醛固定、包埋、切片，HE染色進行組織病理學檢查。

陰道黏膜刺激性試驗組織病理學評分標準如下：按照D’Cruz等提出的小型豬陰道刺激性試驗方法和標準, 通過對陰道黏膜上皮細胞病變（潰瘍/壞死）、炎癥細胞浸潤，黏膜固有層、血管和周圍組織的充血、出血和水腫幾個方面半定量計分來反映刺激的嚴重程度，用無變化“0”、輕微“1”、溫和“2”、中等“3”、嚴重“4”，五個等級表示，總分為3 2分。

1.4流式細胞術檢測陰道灌流液（CVL）中的中性粒

細胞比例

末次給藥后24 h和72 h用10 mL無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.2）對各組小型豬進行陰道灌洗，收集CVL。300×g離心5 min，1.0 μmL PBS（含1%慶大霉素）重懸沉淀，-20 ℃保存。用流式細胞儀檢測，應用CellQuest多功能分析軟件，計數10 000個CVL沉淀細胞。FlowJo軟件計算各門的中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞占檢測細胞總數的百分比（%）。

1.5流式細胞術檢測CVL中CD45+細胞比例

調節CVL沉淀細胞濃度約至5×106/mL, 加入1 000倍稀釋的兔抗豬CD45+多抗, 4 ℃放置30 min，以300×g, 離心5 min, 去上清后, 加入FITC標記的二抗，混合置于暗處, 室溫孵育15 min后, 用流式細胞儀檢測, 結果用CD45+細胞百分率（%）表示。

1.6免疫組織化學法檢測CD45+在陰道黏膜中表達

石蠟切片常規脫蠟，水化，微波加熱進行抗原熱修復，體積分數3%H2O2滅活內源性過氧化物酶活性，滴加100倍稀釋的兔抗CD45+多抗，4 ℃過夜，按照SA1022-兔IgG SABC免疫組織化學染色試劑盒說明操作，DAB室溫顯色，蘇木素輕度復染, 脫水, 透明, 封片后鏡檢, 在20×物鏡下所選視野內用Image-Proplus 6.0病理圖像分析軟件定位,鎖定瀏覽框, 測定框內CD45+表達累積光密度值。

1.7統計分析方法

2　結果

2.1陰道黏膜組織病理學結果

與基質對照組（圖1A）的陰道黏膜上皮細胞層相比, N-9模型組（圖1B）的部分黏膜上皮發生潰瘍、壞死以及炎性細胞浸潤。與基質對照組陰道固有層（圖1C, 1E）相比, N-9模型組（圖1D, 1F）可見多量中性粒細胞（Gra）、單核細胞浸潤、毛細血管充血、出血。

表1　小型豬陰道黏膜刺激性評分結果

2.2組織病理學評分結果

各處理組觀察6張病理切片，分別記錄評分。由表1可見，基質對照組病變總分值為3.3±0.2，N-9 模型組總分值明顯升高為18.0±3.2（P＜0.01）。

圖1　小型豬陰道黏膜HE染色結果

2.3CVL沉淀細胞中Gra比例

由圖2和表2可見，給藥前各處理組小型豬CVL沉淀細胞中，Gra極少（圖2A、2D），組間無明顯差異（P＞0.05）。在末次給藥后24 h，與基質對照組相比，N-9模型組Gra細胞比例明顯升高（圖2B和2E）（P＜0.01）。末次給藥后72 h，與基質對照組相比，N-9模型組Gra細胞比例仍保持很高水平（圖2C和2F）（P＜0.01）。

表2　各處理組不同時間CVL液的中性粒細胞百分率　%

2.4CVL沉淀細胞中CD45+細胞百分率

圖3A顯示，給藥前小型豬CVL中CD45+細胞占27.4%； 而末次給藥后24和72 h CD45+細胞百分率分別可升高到55.1%和87.5%（圖3B和3C）。對各處理組CVL中CD45+細胞百分率進一步分析（表3）,兩組小型豬給藥前CVL中CD45+細胞百分率無顯著性差異（P＞0.05）； 在末次給藥后24 h和72 h, N-9模型組CVL中CD45+細胞百分率均明顯升高（P＜0.01）。

2.5陰道黏膜組織中CD45+的定位表達

末次給藥72 h后，基質對照組CD45+細胞有少量表達，主要位于黏膜固有層，呈顆粒狀或點狀，而在黏膜上皮表達極少（圖4A）； N-9 模型組可見大量CD45+細胞，集中表達于黏膜上皮，染色深且密度高（圖4B）。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件, 測定各處理組累積光密度值表明, N-9模型組CD45+細胞表達的累積光密度值（33.95±6.69），顯著高于基質對照組（23.42±3.30）（P＜0.05）。

圖2　小型豬陰道灌流液的流式細胞術細胞分析

圖3　小型豬陰道灌流液沉淀細胞CD45+細胞FACS分析典型直方圖（BD FITC標記CD45抗體）

3　討論

表3　不同時間各處理組小型豬CVL液CD45+細胞百分率　　　　　　　　　　　　　　　%

本研究探討了運用小型豬建立陰道外用藥物的陰道黏膜免疫炎癥反應模型，用以評價新型陰道外用藥物是否會導致陰道黏膜刺激性及免疫炎癥反應。女性生殖道外用藥物包括外用避孕藥、抗HIV性途徑傳播的殺微生物劑、陰道防御增強劑如益生菌制劑、陰道潤滑劑、以及生殖道抗感染藥物等，品種眾多，應用廣泛。

圖4　小型豬陰道黏膜CD45表達結果

兔陰道刺激模型是用于評價生殖道外用藥物局部安全性的經典模型［1］。本研究對傳統的兔陰道刺激模型進行了改進［11］，運用小型豬，在原有病理和解剖學檢測指標的基礎上，增加了分子水平上的檢測, 這樣不僅能夠反映出黏膜的炎癥情況，而且對免疫系統的激活情況可以有更全面的了解。

本研究結果顯示, 陰道給予40 mg/mL N-9凝膠連續7 d，N-9模型組可見部分黏膜上皮發生潰瘍、壞死以及炎性細胞浸潤； 陰道黏膜固有層可見多量Gra、單核細胞浸潤、毛細血管充血、出血； 半定量病理評分提示N-9模型組分值顯著高于基質對照組,提示小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型造模成功。

國外研究［12］證實, N-9能引起陰道黏膜上皮的損傷和嚴重的組織炎癥反應，激活白介素-1（IL-1）的分泌和核因子-κβ（NF-κβ）的轉錄，從而導致細胞因子（IL-1，IL-6和TNFα）和趨化因子（IL-8、IL-10和吞噬細胞炎癥蛋白）等的釋放，大量炎癥細胞（特別是Gra和CD45+細胞）涌入陰道灌洗液中。CVL中的上述成分的升高與陰道黏膜損傷、免疫炎癥反應甚至HIV感染增加可能相關。本研究結果顯示，在末次給藥后24 h，與基質對照組相比，N-9模型組CVL中性粒細胞比例明顯升高。

采用免疫組織化學技術檢測白細胞共同抗原（leuckocyte common antigen, LCA）-CD45在小型豬陰道黏膜的表達, 可以直觀地觀察到陰道黏膜炎性細胞的分布和免疫細胞的活化情況。若CD45+細胞表達較多則提示該部位的免疫炎癥反應明顯, 候選藥物的局部刺激性明顯。本研究中CD45+細胞免疫組織化學結果表明, 基質對照組陰道黏膜上皮呈現少量散在CD45+細胞, 而N-9 模型組CD45+細胞在黏膜上皮層大量表達。本研究中流式細胞儀檢測結果亦提示CVL中CD45+細胞百分率顯著升高, 該結果與國外報道一致［13］。

綜上所述, 本研究采用廣西巴馬小型豬陰道黏膜免疫炎癥反應模型, 通過流式細胞術、免疫組化與病理學觀察相結合的檢測方法, 檢測CVL中的中性粒細胞比例、CD45+細胞分析以及陰道組織病理改變和組織黏膜中CD45免疫定位表達, 結果均提示N-9誘導陰道黏膜組織的炎癥反應, 破壞了黏膜上皮屏障的完整性, 活化了大量免疫細胞, 顯現出小型豬可作為免疫炎癥反應模型的潛在特點, 證實小型豬可成為一種良好的陰道免疫炎癥評價模型。本研究中關于陰道黏膜免疫炎癥反應的檢測指標, 對擬定陰道殺微生物劑臨床前安全性評價體系具有一定的參考價值。今后, 還需進一步探索建立能客觀全面評價抗HIV陰道殺微生物劑安全性的小型豬模型。

［1］Thompson IO, van der Bijl P, van Wyk CW, et al. A comparative light-microscopic, electron-microscopic and chemical study of human vaginal and buccal epithelium［J］. Arch Oral Biol, 2001, 46（12）：1091-1098.

［2］Davis CC, Kremer MJ, Schlievert PM, et al. Penetration of toxic shock syndrome toxin-1 across porcine vaginal mucosa ex vivo： permeability characteristics, toxin distribution, and tissue damage［J］. Am J Obstet Gynecol, 2003, 189（6）：1785-1791.

［3］D’Cruz OJ, Erbeck D, Uckun FM. A study of the potential of the pig as a model for the vaginal irritancy of benzalkonium chloride in comparison to the nonirritant microbicide PHI-443 and the spermicide vanadocene dithiocarbamate［J］. Toxicol Pathol, 2005, 33（4）：465-476.

［4］Wikinson D, Tholandi M, Ramjea G, et al. Nonoxynol-9

Apermicide for prevention of vaginally acquired HIV and other sexually transmitted infections： sgstematic review and meta-analgsis of randomized controlled trials including more than 5000 women［J］. Lancet Infect Dis, 2002, 2（1）：613-617.

［5］Obiero J, Mwethera PG, Hussey GD, et al. Vaginal microbicides for reducing the risk of sexual acquisition of HIV infection in women： systematic review and meta- analysis［J］. BMC Infect Dis, 2012, 12（5）：289-310.

［6］Patton DL, Cosgrove SY, Paul KJ. A summary of preclinical topical microbicide vaginal safety and chlamydial efficacy evaluations in a pigtailed macaque model［J］. Sex Transm Dis, 2008, 35（10）：889-897.

［7］Peuster M, Fink C, Reckers J, et al. Assessment of subacute inflammatory and proliferative response to coronary stenting in a porcine model by local gene expression studies and histomorphometry［J］. Biomaterials, 2004, 25（6）：957-963.

［8］Catalone BJ, Kislr-Catalone TM, Budgeon LR, et al. Mouse model of cericoraginal toxicity and inflammation for preclinical eraluation of topical vaginal microbicides［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48（5）：1837-1847.

［9］Lard-Whiteford SL, Matecxcka D, O'Rear JJ, et al. Recommendations for the nonclinical development of topical microbicides for prevention of HIV transmission： an update［J］. J Acquir Immune Defic Syndr, 2004, 36（1）：541-552.

［10］ D’Cruz OJ, Uckun FM. Preclinical evaluation of a dual-acting microbicidal prodrug WHI-07 in combination with vanadocene dithiocarbamate in the female reproductive tract of rabbit, pig, and cat［J］. Toxicol Pathol, 2007, 35（7）：910-927.

［11］ Doncel GF, Chandra N, Fichorova RN. Preclinical assessment of the proinflammatory potential of microbicide candidates［J］. J Acquir Immune Defic Syndr, 2004, 37 （Suppl 3）：S174-S180.

［12］ Zalenskaya IA, Cerocchi OG, Joseph T, Donaghay MA, et al. Increased cox-2 expression in human vaginal epithelial cells exposed to nonoxynol-9, a vaginal contraceptive microbicide that failed to protect women from HIV-1 infection［J］. Am J Reprod Immunol, 2011, 65（2）：569-577.

［13］ Cummins JE, Doncel GF. Biomarkers of cervicovaginal inflammation for the assessment of microbicide safety［J］. Sex Transm Dis, 2009, 36（3 Suppl）：S84-S91.

Establishment of Vaginal Mucosal Immunoinflammatory Response Model in Minipig

HUANG Chao1, GONG Yi-juan1, TIAN Fang1, WANG Yu-zhu1, SUN Bing1,2, ZHI Rui-na1,2, XIA Min-jie1, DING Xun-cheng1, ZHOU Xin-chu3, LI Wei-hua1
（1. State Key Lab of Family Planning Drugs and Devices， Shanghai Institute of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032， China； 2. School of Public Health， Fudan University， Shanghai 200032；3. Shanghai Jiao Tong University School of Agriculture and Biology， Shanghai 201101， China）

ObjectiveTo establish the vaginal mucosal immuno-inflammatory model response of minipig. MethodsSix female minipigs were randomly divided into the control and Nonoxynol-9 （N-9）model group （40 mg/mL）. After 12 days of estradiol benzoate intramuscular injection, the test drugs （N-9）were administered through vagina to minipigs at 5 mL/d for 7 consecutive days. On the 7th day, histopathological examination of vaginal mucosa was undertaken and the pathological scores were calculated based on histological indexes including epithelial ulceration/erosion, necrosis, cell infiltration, hemorrhage, congestion and edema. Cervicovaginal lavage （CVL） was collected at 24 h and 72 h after drug administration. The percentage of neutrophilic granulocytes and CD45+cells in the CVL deposited cells were detected by flow cytometry. The expression and location of CD45+cells in the vaginal mucosa were assessed by using immuno-histochemical （IHC） assay. ResultsHistopathological examination showed obvious lesions including inflammation, bleeding and edema in the vaginal epithelium of the N-9 group. Histological score of the N-9 group （18.0±3.2） was significantly higher than that of the control （3.3±0.2）（P＜0.01）. The percentage of neutrophilic granulocytes in the CVL cells of N-9 group was （41.70±1.63）% （24 h） and （51.17±3.81）% （72 h）, and the percentage of CD45+cells in the CVL cells of N-9 group was （58.5±4.73） % （24 h） and （88.0±3.57）% （72 h）, both showed significant increase compared to that of the control （P＜0.01）. CD45+cell expression increased significantly in the N-9 group. The IOD value of N-9 group was 33.95±6.69, which was significantly higher than that of the control group （28.42±8.96）（P＜0.05）. ConslusionThe vaginal mucosal immuno-inflammatory response model of mini-pigs could be induced by giving 40 mg/mL N-9 gel to the mini-pigs through vagina for 7 consecutive days.

Minipig； Nonoxynol-9 （N-9）； Histopathology； Cervicovaginal lavage（CVL）；Immuno-inflammation response； Leuckocyte common antigen-CD45

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0081-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.001

2015-12-07

國家科技重大專項（2013ZX10001006-003-002）； 國家科技重大專項（2012ZX10001007-009-003）； 十二五國家科技支撐計劃（2012BAI31B04）； 上海市科委項目（13431900800）

黃超, 男, 本科, 主要從事新藥研發及生殖藥理評價研究。E-mail： 553026696@qq.com共同第一作者, 弓藝涓, 女, 碩士, 主要從事藥物研發。E-mail： gongyijuan@126.com

李衛華, 女, 博士, 研究員, 主要從事生殖毒理和藥物安全評價研究。E-mail： iamliwehua@foxmail.com