奧曲肽對局灶性腦缺血的保護作用

丁　雷, 王守寶, 宋鶴杰, 王　曄（上海兒童醫學中心, 上海200127）

奧曲肽對局灶性腦缺血的保護作用

丁雷, 王守寶, 宋鶴杰, 王曄
（上海兒童醫學中心, 上海200127）

目的觀察奧曲肽（OCT）對局灶性缺血再灌注的保護作用并探討相關作用機制。方法80只SD大鼠隨機分為4組，分別為假手術組，缺血再灌注組，OCT低劑量組及OCT高劑量組。在建立缺血再灌注模型各組分別使用安慰劑或OCT處理。參照Longa 5分制評分標準，分別在再灌注后的各觀察時間段對大鼠進行神經功能評分； 腦組織標本分別采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色進行梗死面積檢測，并采用試劑盒檢測丙二醛（MDA）和過氧化物歧化酶（SOD）含量。結果高劑量OCT能夠顯著改善腦缺血再灌注組大鼠的功能評分。OCT高劑量組動物梗死面積明顯小于缺血再灌注組（P＜0.05），MDA在OCT高劑量組的活性分別顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05），而SOD的活性OCT組則顯著升高（P＜0.05）。結論OCT在大鼠腦缺血再灌注具有保護作用，可能是通過影響腦部的氧化來產生作用的。

奧曲肽（OCT）； 缺血再灌注； 梗死面積； 過氧化物歧化酶（SOD）； 丙二醛（MDA）

缺血性腦損傷是影響人類的身體健康的重要疾病之一，其具有發病率、致殘率、死亡率及復發率高的特點［1］，因此，有效預防和控制該疾病具有重要意義。目前，腦缺血的治療措施主要采用早期溶栓來保護急性期的神經功能，該方法被認為無法有效地改善缺血性損傷所致的長期病理損傷［2］。奧曲肽（OCT），是一種合成的環狀八肽，先前研究［3］認為其能夠通過抗炎癥及抗氧化效應來治療急性胰腺炎和視網膜及腸道的缺血再灌注損傷。然而其在局灶性腦缺血中的效應仍不明確。

本文采用改良的Longa線栓法［4］建立大鼠腦缺血再灌注模型, 采用OCT治療后，通過對大鼠進行神經功能評分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色觀察腦梗死情況以及檢測腦組織中丙二醛（MDA）和過氧化物歧化酶（SOD）水平，探討OCT在腦缺血過程中的可能的保護作用，繼而為其可能在臨床上的治療提供基礎。

1　材料與方法

1.1動物與分組

清潔級雄性SD大鼠80只，體質量210～260 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SYCK（滬）2012-0002］，飼養于仁濟醫院清潔級設施［SYXK（滬）2011-0121］，實驗過程中動物的飼養和取材均遵守實驗動物管理與保護的有關規定。SD大鼠隨機分為假手術組（Sham）（n=20）、腦缺血再灌注模型組（MACO）（n=20）、低劑量OCT組（OCT-L）（n=20）及高劑量OCT組（OCT-H）（n=20）。

1.2大鼠腦缺血再灌注模型制作

根據Longa等［4］所描述的方法建立大鼠腦缺血模型。步驟如下： 將動物稱體質量后采用體積分數3%戊巴比妥鈉40 mg/kg進行麻醉，采用仰臥位對動物進行固定，脫毛膏脫毛后采用碘伏消毒頸部皮膚。切開皮膚后分離左側頸總動脈、頸外及頸內動脈。在頸總動脈近心端及頸外動脈進行結扎后，將栓線在頸總動脈、分叉處近心端1 mm處插入到頸總動脈，將栓線經頸內動脈送至顱內，栓線插入深度約為距離頸內及外動脈分叉約18 mm處，Sham組插線深度約為13 mm，隨后將切口縫合，將線頭留置于體外, 90 min后進行再灌注時, 輕輕提拉插線, 有阻力時提示栓線頭端已達頸總動脈切口處, 實現再灌流。術中術后室溫控制在25～27 ℃,視動物狀況注射速尿或抗生素預防腦水腫和感染。所有大鼠均采用相同的飼料喂養, OCT-L和OCT-H組在腦缺血后分別立即腹腔注射50 μg/kg和100 μg/kg的OCT, Sham組和MACO組注射相同劑量的生理鹽水。

1.3采集樣本

各組大鼠在給藥后24 h，體積分數3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉起效后，斷頭器斷頭，經枕骨大孔開顱，取出腦組織，采用生理鹽水進行清洗，冠狀位視交叉前后約2 mm處取少量腦組織用于后續實驗。

1.4神經功能評分

參照Longa［4］5分制評分標準, 分別在模型建立后24 h進行神經功能評分。0級, 無神經損傷癥狀；1級, 提尾時右前肢內收屈曲, 不能完全伸展； 2級，爬行時向右側旋轉、劃圈； 3級，站立時向右側傾倒； 4級，無自主活動伴意識障礙； 5級, 死亡。

1.5腦部水容量

在模型建立24 h，各組大鼠分別用體積分數3%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭取腦（整個過程需快速），用濾紙吸干大腦表面水分和血液。取患側大腦半球在干燥的器皿中進行稱量，計為濕重。隨后將腦半球放入電熱干燥箱中（120 ℃）進行烘干，稱量后計為干重并計算腦水含量［=（濕重-干重）/濕重×100%］。

1.6TTC染色

在模型建立的24 h時間點在將各組大鼠的腦組織迅速取下后將左室切成2 mm左右組織片，采用質量分數1%TTC（磷酸緩沖液配制）溶液37 ℃避光孵育20 min，拍照。按照正常心肌為鮮紅色，梗死心肌為白色進行梗死面積的定量。

1.7MDA和SOD測定

取腦組織制備組織勻漿，采用試劑盒（南京建成生物制品公司）測其MDA和SOD含量，所有操作按照廠商提供的說明書進行。

1.8統計學方法

所有統計學分析采用SPSS17.0統計軟件進行。定量數據以均數±標準差（± s）表示, 多組間及兩組間比較分別采用單因素方差分析（One way-ANOVA）及Student t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1高濃度OCT能夠減弱神經功能缺陷

在MCAO模型建立后，采用5分制的方法檢測了神經功能缺陷。與MACO組相比，OCT-H組大鼠的神經功能缺陷積分顯著下降（P＜0.05, 表1），而OCT-L組與MCAO組無顯著差異。

表1　大鼠神經功能缺陷積分

2.2高濃度OCT能夠減弱腦水腫

在模型建立后24 h, 假手術組腦部水容量為78.94%±0.40%。與MACO組（86.93%±0.51%）相比，OCT-L組（84.78%±0.93%）和OCT-H組（83.36%±0.96%）在缺血半球的腦水含量均有顯著下降（P＜0.05）。

2.3高濃度的OCT能夠顯著降低腦梗死體積

在假手術組未觀察到梗死情況, 而MACO組的條紋和側面皮質均存在廣泛的損傷。高劑量OCT能夠顯著降低梗死體積（P＜0.05，表2和圖1），OCT-L組與MCAO組不存在顯著差異。

表2　大鼠腦梗死體積分析　　　　　　%

2.4OCT處理對MACO大鼠SOD和MDA活性

影響

對腦皮質組織中的SOD和MDA的活性進行檢測來評價缺血24 h后氧化應激反應。與MACO組相比，無論是高劑量還是低劑量的OCT能夠顯著增加SOD的活性，并降低MDA的生成（表3）。

3　討論

本研究中，高劑量OCT能夠顯著改善MACO小鼠的功能評分。OCT高劑量組大鼠腦梗死面積明顯小于缺血再灌注組（P＜0.05）。MDA在OCT高劑量組的活性顯著低于缺血再灌注組（P＜0.05），而SOD的活性OCT組則顯著升高（P＜0.05）。結果顯示，OCT在大鼠腦缺血再灌注中具有保護作用，可能是通過影響腦部的氧化產生作用。這些結果為今后臨床應用提供實驗依據。

MCAO是一種經典的用于研究腦部缺血損傷的機制的動物模型［5］。在腦缺血發生后的幾分鐘內,腦部組織先后出現細胞毒性應答、氧化應激、炎癥應答、細胞死亡及神經損傷［6,7］。氧化應激和炎癥應答被認為是腦部缺血性損傷的基本機制。因此，抗氧化和抗炎癥的藥物被認為具有潛在的治療效應, 這些藥物能夠對缺血性損傷產生保護作用［8］。

OCT被認為能夠在多種疾病中減輕氧化及炎癥損傷，然而有關OCT在缺血性中風中的效應目前知之甚少。由于OCT為水溶性，其在生理條件下通常難以通過血腦屏障。盡管如此，有報道［9］認為在腦梗或腦腫瘤時會出現血腦屏障紊亂的情況，這就使OCT能夠進入到受影響的區域。本文結果顯示，在缺血性中風后輸入OCT能夠有效減輕神經功能失調、減少腦梗死的體積和腦水腫。

MDA為脂質過氧化的產物，是氧化應激的標志物，其表達水平反映了脂質過氧化的速率和范圍，也代表了氧自由基的清除能力。研究［10］顯示，在缺血大腦中MDA水平顯著增加，而OCT能夠明顯抑制MDA的水平。該結果表明OCT能夠通過清除自由基來減輕氧化應激，同時減少脂質過氧化的程度。SOD作為一種內源性的抗氧化酶，在機體的氧化和抗氧化平衡中具有重要作用。本研究通過檢測腦皮質組織中的SOD和MDA的活性證實了OCT能夠通過上調內源性抗氧化酶來減輕缺血性中風的抗氧化應激。

綜上所述，本文結果顯示OCT在大鼠腦缺血再灌注中具有保護作用，可能是通過影響腦部的氧化產生作用。

圖1　OCT處理MACO大鼠腦梗死體積觀察

表3　大鼠SOD和MDA活性水平

［1］Donnan GA, Fisher M, Macleod M, et al. Stroke［J］. Lancet, 2008, 371（9624）：1612-1623.

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［3］Jingmin O, Xiping Z, Chun W, et al. Study of dexamethasone, baicalin and octreotide on brain injury of rats with severe acute pancreatitis［J］. Inflamm Res, 2012, 61（3）：265-275.

［4］Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989, 20（1）：84-91.

［5］Yang C, Zhang X, Fan H, et al. Curcumin upregulates transcription factor nrf2, ho-1 expression and protects rat brains against focal ischemia［J］. Brain Res, 2009, 1282：133-141.

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Protective Effects of Octreotide on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rat

DING Lei, WANG Shou-bao, SONG He-jie, WANG Ye
（Shanghai Children’s Medical Center， Shanghai 200127， China）

ObjectiveTo observe the effect of octreotide （OTC） on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and explore the related mechanism. MethodsEighty SD rats were randomly divided into 4 groups which were sham group, middle cerebral artery occlusion （MACO） group, low dosage OCT （OCT-L） and high dosage OCT （OCT-H） group. All the rats were treated with OCT or placebo immediately after establishing the MACO model. Neurologic examination was clinically performed on each rat after reperfusion according to the Longa’s scoring method. The brain tissues were then harvested and tested with triphenyltetrazolium chloride staining. The malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） activity of brain was also tested. ResultsCompared with MCAO group, OCT significantly alleviated neurological deficit, lessened infarct volume （P＜0.05）. The activity of MDA were decreased significantly in the OCT treated group than MACO group （P＜0.05）, but the SOD increased significantly in the OCT-H group than MACO group （P＜0.05）. ConclusionOCT treatment generated protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

Octreotide（OCT）； Ischemia-reperfusion injury； Infarction area； Superoxide dismutase（SOD）；Malondialdehyde （MDA）

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0113-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.006

2015-12-10

新華集團基金（12Xj2208）

丁雷（1984-）, 男, 實驗師。E-mail： dingleipang@163.com

王曄（1982-）, 男, 助理研究員。E-mail： ye.wang@live.cn