前肢畸形WHBE兔血清鈣、磷、堿性磷酸酶含量檢測及骨密度分析

陳方明， 徐劍欽， 朱科燕， 楊欽欽， 陳民利（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心， 杭州 310053）

前肢畸形WHBE兔血清鈣、磷、堿性磷酸酶含量檢測及骨密度分析

陳方明， 徐劍欽， 朱科燕， 楊欽欽， 陳民利
（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心， 杭州 310053）

目的 觀察前肢畸形WHBE （FMWHBE） 兔前肢生理、病理特點和血清鈣（Ca）、磷（P）含量等生化特性，探討前肢畸形的可能成因及作為骨質(zhì)疏松等骨生物力學(xué)研究模型的可能性。方法 分別選取1、2、3、4月齡FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白（JPW）兔，每個月齡階段各6只。檢測所有實驗兔血清鈣（Ca）、磷（P）和堿性磷酸酶（ALP）含量； 用小動物成像系統(tǒng)X射線成像后測量前肢肱骨、橈骨、尺骨骨密度（BMD），并經(jīng)HE染色后，進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果 與JPW兔比較，1、2、4月齡FMWHBE兔血清Ca含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），4月齡FMWHBE兔血清P含量顯著升高（P＜0.05）。FMWHBE兔血清ALP水平顯著低于WHBE兔和JPW兔組（P＜0.05或P＜0.01）； 與同期正常WHBE兔比較，1～4月齡FMWHBE兔肱骨和2、3、4月齡橈骨及1、2月齡FMWHBE兔尺骨BMD均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），與同期正常JPW兔比較，1、3月齡肱骨、橈骨和1、2月齡尺骨BMD均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）； 病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與WHBE兔JPW兔比較，F(xiàn)MWHBE兔前肢肱骨、橈骨、尺骨骨皮質(zhì)較薄，局部骨組織表面成骨細(xì)胞較少，未見整齊排列成一層，骨小管數(shù)量較少，新生骨組織較少。結(jié)論 FMWHBE兔前肢畸形可能與較低的血Ca和ALP水平導(dǎo)致BMD的降低以及成骨細(xì)胞減少、新生骨較少有關(guān)。

前肢畸形WHBE （FMWHBE） 兔； 骨密度（BMD）； 鈣（Ca）； 磷（P）； 堿性磷酸酶（ALP）

WHBE（white hair and black eyes）兔， 是我中心從日本大耳白（JPW）兔中發(fā)現(xiàn)的毛色為白色、眼睛為黑色的實驗兔，現(xiàn)已近交育成封閉群實驗兔， 又名JPW兔黑眼系。WHBE兔具有高產(chǎn)仔率和易產(chǎn)生高效價抗體的免疫學(xué)特性，已在藥品檢測和抗體制備等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。在育種生產(chǎn)過程中， 有部分幼年WHBE兔自發(fā)前肢畸形， 表現(xiàn)為前肢外展， 無法內(nèi)收直立，足部無力支撐， 僅靠前肢整體著地支撐體重， 呈趴臥姿態(tài)， 且前肢橈骨、尺骨畸形， 畸形發(fā)生率約10%。本實驗檢測了1、2、3、4月齡的前肢畸形WHBE（FMWHBE）兔前肢肱骨、橈骨、尺骨骨密度（BMD）， 對血清鈣（Ca）、磷（P）和堿性磷酸酶（ALP）水平進(jìn)行檢測， 并與同期JPW兔、正常WHBE兔進(jìn)行對比， 探討WHBE兔自發(fā)前肢畸形的可能成因，并為探討FMWHBE兔是否可能成為自發(fā)性骨質(zhì)疏松模型動物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

分別選取1、2、3、4月齡普通級FMWHBE兔、WHBE兔和JPW兔各6只，共72只，來源于新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場［SCXK（浙）2009-0042］；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心 ［SYXK（浙）2008-0116］，飼料Ca、總P含量分別為1.5%、0.8%，符合GB 14924.3-2010標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)室溫度22±2 ℃，相對濕度50%±5%， 12 h/12 h明暗交替，光照強度150 lx。

1.2 主要儀器和試劑

日立7020全自動生化儀、Image Station小動物成像系統(tǒng)、STP120脫水機(jī)、AP280-2包埋機(jī)、Leica半自動切片機(jī)、Nikon eclipse 80i顯微鏡等。血清Ca 試劑盒，批號：18288/00001221； P試劑盒，批號: 520071/50001715； ALP試劑盒，批號: 07086/00000821，以上生化試劑均購自德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司； 進(jìn)口脫鈣液，批號: 20999，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

將FMWHBE兔組、WHBE兔組和JPW兔組各月齡實驗兔耳動脈取血5 mL， 以2 095×g離心10 min，分離血清，用日立7020全自動生化儀檢測血清Ca、P和ALP； 用體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉1 mL/kg麻醉后處死各組實驗兔，取前肢，立即用小動物成像系統(tǒng)X射線成像后測量肱骨、橈骨、尺骨BMD。分離前肢肌肉后用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，快速脫鈣1周后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片和HE染色。

骨質(zhì)疏松判斷標(biāo)準(zhǔn)：Kedak Image Station自帶圖像分析軟件對X光成像后的前肢骨進(jìn)行BMD測量。根據(jù)文獻(xiàn)，采用同齡正常動物BMD值作為對照，以BMD統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯著降低作為骨質(zhì)疏松癥的判斷標(biāo)準(zhǔn)［1，2］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清Ca、P和ALP水平

1、2、4月齡FMWHBE兔和WHBE兔血清Ca含量顯著低于JPW兔組（P＜0.05或P＜0.01）； 4月齡FMWHBE兔和WHBE兔血清P含量顯著高于同期JPW兔組（P＜0.05或P＜0.01）， 3月齡WHBE兔血清P含量顯著高于FMWHBE兔和JPW兔組（P＜0.01）；4月齡FMWHBE兔Ca/P顯著低于JPW兔； FMWHBE兔血清ALP水平顯著低于WHBE兔和JPW兔組（P＜0.05或P＜0.01），WHBE兔和JPW兔組未見明顯差異。

2.2 前肢肱骨、橈骨、尺骨BMD變化

各組實驗兔BMD測量結(jié)果顯示：1、2、3、4月齡FMWHBE兔肱骨BMD均顯著低于WHBE兔組（P＜0.05或P＜0.01）， 1、3月齡肱骨BMD顯著低于JPW兔組（P＜0.01）； 1、3月齡FMWHBE兔橈骨BMD顯著低于JPW兔組（P＜0.05或P＜0.01）， 2、3、4月齡FMWHBE兔橈骨BMD顯著低于WHBE兔組（P＜0.05或P＜0.01）； 1、2月齡FMWHBE兔尺骨BMD顯著低于WHBE兔和JPW兔組（P＜0.01）；WHBE兔除1月齡橈骨BMD顯著低于JPW兔組（P＜0.05）外，其余各月齡肱骨、橈骨、尺骨BMD未見明顯差異。

表 1 各組實驗兔不同月齡血清Ca、P和ALP水平Table 1 Changes of the levels of serum Ca， P and ALP in rabbits of different ages

表 2 各組實驗兔不同月齡前肢肱骨、橈骨、尺骨BMD結(jié)果 g/cm2Table 2 The results of bone mineral density of fore humerus， radius and ulna in rabbits of different ages

2.2 肱骨、橈骨、尺骨病理變化

A: FMWHBE肱骨； B: FMWHBE橈骨； C: FMWHBE尺骨； D: WHBE肱骨； E: WHBE橈骨； F: WHBE尺骨；G: JPW肱骨； H: JPW橈骨； I: JPW尺骨（HE×100）圖 1 一月齡實驗兔前肢肱骨、橈骨、尺骨病理形態(tài)A: FMWHBE fore humerus； B: FMWHBE radius； C: FMWHBE ulna； D: WHBE fore humerus； E: WHBE radius；F: WHBE ulna； G: JPW humerus； H: JPW radius； I: JPW ulna （HE×100）Figure 1 Pathological changes of fore humerus， radius and ulna in 1 month rabbits

病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)， JPW和WHBE兔肱骨、橈骨、尺骨骨組織表面可見排列成一層的成骨細(xì)胞，可見大量骨小管和新生骨組織， 骨皮質(zhì)較厚； FMWHBE兔前肢肱骨、橈骨、尺骨骨皮質(zhì)較薄，局部骨組織表面成骨細(xì)胞較少， 未見整齊排列成一層，骨小管數(shù)量較少， 新生骨組織較少， 骨小梁相對較少。以上病理變化尤其以1月齡實驗兔對比明顯（圖1）。

3 討論

Ca是骨骼的重要組成部分，參與骨路的生長發(fā)育，有利于保持體內(nèi)礦物質(zhì)的平衡和骨平衡。血Ca主要以3種形式存在，即離子Ca、蛋白結(jié)合Ca和與小分子陰離子結(jié)合的Ca。離子Ca具有Ca的生理活性，約占血清總Ca的47%［3，4］。本實驗在相同飼養(yǎng)條件下，1、2、4月齡FMWHBE兔血清Ca含量顯著低于JPW組，提示FMWHBE兔BMD的降低可能與血Ca水平較低有關(guān)。P大部分存在于骨礦物質(zhì)中， 不但具有維持機(jī)械強度的作用， 且以無機(jī)P的形式存在于骨中維持細(xì)胞內(nèi)P的穩(wěn)定［1，4］。血Ca、血P與骨骼中的Ca、P保持動態(tài)平衡，血Ca、血P含量的測定能反映出骨組織的代謝情況，而Ca、P比例的失調(diào)，P水平增高可能通過刺激甲狀旁腺激素分泌增加，引發(fā)高P血癥和低Ca血癥，導(dǎo)致BMD降低［5，6］。本實驗中4月齡FMWHBE兔血清P含量較高而血清Ca/P低于于同期JPW兔，提示W(wǎng)HBE兔前肢畸形可能存在血清Ca、P比例異常有關(guān)。ALP是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，主要存在于細(xì)胞的質(zhì)膜， 是普遍存在的胞內(nèi)酶，是臨床上常見的評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)之一［7］。成骨細(xì)胞的活性及成骨作用的變化與血清ALP的活性密切相關(guān)，較高ALP活性對分解磷酸酯的無機(jī)磷促進(jìn)骨基質(zhì)礦化具有積極作用［8］。FMWHBE兔血清ALP水平顯著低于WHBE兔和JPW兔組，且FMWHBE 兔1、2、3、4月齡肱骨BMD、1、3月齡的橈骨和1、2月齡尺骨BMD顯著低于JPW兔，結(jié)果提示低水平的ALP可能影響FMWHBE兔骨基質(zhì)的礦化，使BMD降低。在本實驗中，F(xiàn)MWHBE兔和WHBE兔擁有相似的血清Ca、P含量，但ALP水平顯著低于WHBE兔，而WHBE兔除1月齡橈骨BMD顯著低于JPW兔外，BMD與JPW兔相近，因此低ALP水平導(dǎo)致骨基質(zhì)礦化較低可能是影響WHBE兔發(fā)生BMD降低和前肢畸形的主要因素。

根據(jù)骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)MWHBE兔的肱骨、橈骨、尺骨均存在一定程度的骨質(zhì)疏松，且病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，F(xiàn)MWHBE兔肱骨、橈骨、尺骨與WHBE兔和JPW兔相比，骨皮質(zhì)變薄，成骨細(xì)胞和新生骨組織較少。綜上所述，F(xiàn)MWHBE兔可能適合作為骨生物力學(xué)研究的模型動物。

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Determination of Serum Calcium， Phosphorus and Alkaline Phosphatase Levels and Forelimb Bone Mineral Density in Forelimb Malformed White Hair and Black Eyes Rabbits

CHEN Fang-ming， XU Jian-qin， ZHU Ke-yan， YANG Qin-qin， CHEN Min-li
（The Research Center of Animal Experiment， Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310053， China）

Objective To observe the physiological and pathological characteristics of forelimb and serum calcium （Ca） and phosphorus （P） levels in forelimb malformed white hair and black eyes （FMWHBE）rabbits， to discuss the possible causes of forelimb malformation in white hair& black eyes （WHBE）rabbits， and to evaluate possibility of FMWHBE rabbit as a potential model in bone biomechanics research such as spontaneous osteoporosis animal model. Method Totally 1， 2， 3 and 4 months old FMWHBE rabbits， WHBE rabbits and Japan white （JPW） rabbits were used respectively （6 rabbits in each group，totally 72 rabbits）.The levels of serum Ca， P and alkaline phosphatase （ALP） were tested in all rabbits. The bone mineral density （BMD） of fore humerus， radius and ulna were measured by using X-ray imaging system. Pathologic analysis was performed by H&E staining. Results Compared with JWP rabbits， the serum Ca content of 1， 2 and 4 months old FMWHBE rabbits was significantly lower （P＜0. 05 or P＜0.01）. The serum P content of 4 months old FMWHBE rabbits was significantly higher than JPW rabbits at the same age（P＜0.05 or P＜0.01）. The serum ALP levels of FMWHBE rabbits was significantly lower than JPW rabbits and WHBE rabbit （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with the same period WHBE rabbit， the BMD of fore humerus of 1-4 month old FMWHBE rabbit ， radial of 2， 3， 4-month-old rabbit and ulna of 2-month-old FMWHBE rabbit were significantly lower （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with the same period JPW rabbits ， the BMD of fore humeral and radius of 1， 3 months old rabbits， the ulna of 1， 2-month old rabbits were significantly lower （P＜0.05 or P＜0.01）. Compared with WHBE and JPW rabbits， the cortex of fore humerus， radius and ulna in FMWHBE rabbits was thinner. There were less osteoblasts on local bone tissue surface and none of them were arranged in a layer trimly. Bone canalicules and new bone tissue were less. Conclusion The malformation of FMWHBE rabbits may be related with the low levels of Ca and P in blood leading the loss of osteoblasts and new bone tissue.

Forelimb malformed white hair& black eyes （FMWHBE） rabbits； Bone mineral density （BMD）； Calcium（Ca）； Phosphorus（P）； Alkaline Phosphatase（ALP）

Q95-33

A

1674-5817（2016）01-0019-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.004

2015-02-11

浙江省科技廳公益性（動物平臺）項目（2012C37079）

陳方明（1981-）， 男， 實驗師， 研究方向: 實驗動物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: ucika@sina.com

陳民利（1963-）， 女， 教授， 研究方向: 實驗動物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@aliyun.com