T-SPOT及肺泡灌洗液T細胞亞群檢測在肺結(jié)核及肺結(jié)節(jié)病鑒別診斷中的意義

孫海柏,張麗霞,王　瀟,劉佳慶,劉　雅,曹　宏

(天津市海河醫(yī)院檢驗科　300350)

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·臨床研究·

T-SPOT及肺泡灌洗液T細胞亞群檢測在肺結(jié)核及肺結(jié)節(jié)病鑒別診斷中的意義

孫海柏,張麗霞,王瀟,劉佳慶,劉雅,曹宏

(天津市海河醫(yī)院檢驗科300350)

目的探討結(jié)核分枝桿菌T細胞斑點試驗(T-SPOT)及肺泡灌洗液T細胞亞群檢測在肺結(jié)節(jié)病和肺結(jié)核鑒別診斷中的作用。方法選擇2010年1月至2015年9月該院確診的50例肺結(jié)節(jié)病和123例肺結(jié)核患者進行T-SPOT和肺泡灌洗液T細胞亞群檢測，并對結(jié)果進行統(tǒng)計和分析。結(jié)果肺結(jié)節(jié)病患者中T-SPOT陽性率為4.0%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分比分別為(88.79±5.34)、(63.58±20.56)、(27.42±6.76)%，CD4+/CD8+比值為2.32±2.0；肺結(jié)核患者中T-SPOT陽性率為90.2%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T細胞百分比分別為(75.10±11.20)、(44.52±7.30)、(32.10±12.30)%，CD4+/CD8+比值為1.30±1.20。肺結(jié)節(jié)病患者較肺結(jié)核患者CD3+和CD4+T細胞明顯增多,CD4/CD8比值升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD8+T細胞有所下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺結(jié)核患者T-SPOT陽性率明顯高于肺結(jié)節(jié)病患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論T-SPOT以及肺泡灌洗液T細胞檢測適用于快速鑒別診斷肺結(jié)節(jié)病與肺結(jié)核。

結(jié)核分枝桿菌T細胞斑點試驗；T細胞亞群；肺結(jié)節(jié)?。环谓Y(jié)核

肺結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可侵入許多臟器，以肺部結(jié)核感染最為常見，排菌者為其重要的傳染源。結(jié)節(jié)病是一種病因不明的以非干酪樣壞死性肉芽腫性病變?yōu)椴±硖卣鞯募膊。衫奂叭矶嘞到y(tǒng)器官受累，臨床表現(xiàn)多樣,缺乏特異性,易造成漏診和誤診。目前常用的結(jié)節(jié)病實驗室診斷方法有支氣管肺泡灌洗液檢查、組織病理學檢查等，因其與結(jié)核病有許多相似之處且常被誤診為結(jié)核病，并按照結(jié)核病治療方案進行治療[1]。本文對臨床確診的50例肺結(jié)節(jié)病患者以及123例肺結(jié)核確診患者的結(jié)核分枝桿菌T細胞斑點試驗(T-SPOT)結(jié)果與肺泡灌洗液中T細胞亞群結(jié)果進行比較分析，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇本院2010年1月至2015年9月收治的123例肺結(jié)核患者及50例臨床確診的肺結(jié)節(jié)病患者為研究對象，其中男112例、女61例，年齡35～78歲。肺結(jié)核確診患者診治前有低熱(午后為主)、盜汗、乏力、食欲缺乏、消瘦、女性月經(jīng)失調(diào)等癥狀，呼吸道有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難等癥狀，影像學檢查顯示胸部有陰影，結(jié)核菌培養(yǎng)陽性。肺結(jié)節(jié)病患者均經(jīng)臨床特征、影像學檢查、病理活檢確診，符合肺結(jié)節(jié)病診斷標準[2]。

1.2方法

1.2.1T-SPOT試劑為英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的結(jié)核感染T細胞檢測試劑(T-SPOT.TB),采用酶聯(lián)免疫斑點試驗在已包被抗γ-干擾素抗體微量板的4個孔中，分別加入50 μL AIM細胞培養(yǎng)液作為陰性對照，50 μL植物血凝素作為陽性對照，50 μL結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽A(ESAT-6抗原)作為測試孔A，50 μL結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽B(CFP-10抗原)作為測試孔B，然后在每個孔中加人含250 000個細胞的上述懸液。把微量板放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板4次，加入50 μL新鮮配制的堿性磷酸酶標記的小鼠抗γ-干擾素單克隆抗體，將培養(yǎng)板在2～8 ℃孵育1 h。孵育后用PBS洗板4次。最后每孔加入底物工作液50 μL，室溫反應7 min。以蒸餾水沖洗終止反應，在干燥培養(yǎng)板中37 ℃ 2～3 h或室溫過夜，計數(shù)斑點形成細胞(SFCs)。根據(jù)抗原A和/或抗原B孔的反應判斷結(jié)果:(1)如果陰性對照孔SFCs為0～5，抗原A和/或抗原B孔SFCs減去陰性對照孔SFCs≥6視為陽性;(2)當陰性對照孔SFCs≥6，抗原A和/或抗原B孔SFCs≥2倍陰性對照孔SFCs視為陽性[3]。

1.2.2肺泡灌洗液T細胞亞群檢測采用美國BD公司FACSCanⅡ流式細胞儀進行檢測,CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP三色熒光抗體及同型對照、紅細胞裂解液購自BD公司。(1)肺泡灌洗液樣品的制備。新鮮肺泡灌洗液經(jīng)尼龍布濾除雜質(zhì)和痰液,離心洗滌2次,計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞數(shù)為每管(2～10)×106/mL,加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP熒光抗體室溫避光孵育20 min,加10%配制的紅細胞裂解液2 mL避光10 min,300 r/min離心5 min,棄上清液,加PBS 2 mL離心洗滌,用0.5 mL PBS重懸細胞。同時以另一管做同型對照。(2)流式細胞儀測定。以熒光微球7-colour校準儀器光路使其分辨率達到最佳工作狀態(tài),采用Canto軟件獲取與分析數(shù)據(jù)。調(diào)節(jié)電壓、閾值、補償使細胞在圖中分布于合適的位置,在FSC/SSC圖中圈出淋巴細胞群為R1,SSC/CD3圖中以CD3+細胞群圈門(R2)以排除巨噬細胞、碎片及其他成分的干擾,建立CD4/CD3、CD8/CD3散點圖并設(shè)置為顯示G3=R1×R2門內(nèi)的細胞,獲取細胞總數(shù)10 000個,根據(jù)同型對照設(shè)十字門分析Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)細胞的表達情況,同時計算出CD4+/CD8+比值。

2　結(jié)　　果

2.1兩組患者T-SPOT結(jié)果比較肺結(jié)核組的陽性率為90.2%，肺結(jié)節(jié)組陽性率為4.0%，肺結(jié)核組患者的陽性率明顯高于肺結(jié)節(jié)病組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　　兩組患者T-SPOT結(jié)果比較(n)

2.2兩組患者T細胞亞群結(jié)果比較肺結(jié)節(jié)病組患者較肺結(jié)核組CD3+和CD4+T細胞明顯增多,CD4/CD8比值升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD8+T細胞有所下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3兩種方法檢測結(jié)果分析同時比較兩組患者T-SPOT及肺泡灌洗液T細胞亞群檢測結(jié)果，以T-SPOT的結(jié)果對肺結(jié)核和肺結(jié)節(jié)病進行篩查，發(fā)現(xiàn)T-SPOT結(jié)果陰性而T細胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+比值有增高者，患肺結(jié)節(jié)病的概率較高。見表3。

表2　　兩組患者T細胞亞群結(jié)果比較±s)

表3　　兩種方法檢測結(jié)果分析±s)

3　討　　論

國外研究表明肺結(jié)節(jié)病的診斷常被延誤，即使懷疑為肺結(jié)節(jié)病的患者仍存在延誤診斷的情況，且常被誤診為肺結(jié)核病，并已按照結(jié)核病治療方案進行治療。肺結(jié)節(jié)病與肺結(jié)核的鑒別診斷仍是目前醫(yī)療領(lǐng)域的一大難點。

近年來，正電子發(fā)射計算機斷層顯像技術(shù)在的診斷中嶄露鋒芒[4-5]。有研究報道，肺結(jié)節(jié)病患者經(jīng)激素治療后肺泡灌洗液中淋巴細胞比例及CD4+/CD8+比值較治療前均有明顯下降，進一步提示肺泡灌洗液檢查對肺結(jié)節(jié)病活動性的判斷價值[6]。也有學者提出，檢測肺泡灌洗液中HLA-DR+、CD8+T細胞及自然殺傷細胞可提高診斷的準確性，可以鞏固肺泡灌洗液檢查在肺結(jié)節(jié)病診斷中的地位[7-8]，為進一步研究肺結(jié)節(jié)病的發(fā)展和診斷提供線索。同時T-SPOT檢測時間較短，并具有較高的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值，是結(jié)核病的理想篩查方法[9-10]，肺泡灌洗液中T細胞亞群檢測可作為肺結(jié)節(jié)病的輔助診斷。

本研究采用T-SPOT和肺泡灌洗液T細胞亞群進行檢測，結(jié)果顯示在T-SPOT中肺結(jié)核組的陽性率為90.2%，肺結(jié)節(jié)組陽性率為4.0%，肺結(jié)核組患者的陽性率明顯高于肺結(jié)節(jié)病組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過此項檢測能初步對兩種疾病進行鑒別。隨后進行肺泡灌洗液中T細胞亞群的檢測，結(jié)果顯示肺結(jié)節(jié)病患者較肺結(jié)核患者CD3+和CD4+T細胞明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CD8+T細胞有所下降,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，CD4+/CD8+比值升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步以T-SPOT的結(jié)果進行肺結(jié)核和肺結(jié)節(jié)病的篩查，發(fā)現(xiàn)T-SPOT結(jié)果陰性而T細胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+的比值有增高者，為肺結(jié)節(jié)病的概率較高。但是本研究中所涉及的樣本量較少，故其臨床應用價值尚待加大樣本量分析及進一步深入探討證實。

綜上所述，在充分考慮患者臨床癥狀的基礎(chǔ)上，首先通過T-SPOT檢測初步排除肺結(jié)核，在檢測出陰性結(jié)果后通過肺泡灌洗液的T細胞亞群的進一步檢測能很大程度幫助臨床醫(yī)師進行肺結(jié)核與肺結(jié)節(jié)病的鑒別診斷。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.046

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1673-4130(2016)17-2465-03

2016-02-21

2016-04-16)