作物改良領域人工核酸酶技術全球專利布局分析

何湘瓊，趙永江，譚永華，田 野，田文文，朱 寧，潘衛東*

(1.國家知識產權局專利局專利審查協作湖北中心，湖北武漢 430070；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002)

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作物改良領域人工核酸酶技術全球專利布局分析

何湘瓊1，趙永江1，譚永華2，田 野1，田文文1，朱 寧1，潘衛東2*

(1.國家知識產權局專利局專利審查協作湖北中心，湖北武漢 430070；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002)

利用德溫特世界專利索引數據庫(DWPI)，分析作物改良領域人工核酸酶技術專利布局，揭示關鍵技術發展方向和趨勢、技術分布區域、專利申請人情況、競爭對手情況以及各技術方向對應的技術功效分布，以期為我國研究者的技術研發和專利布局提供參考。

人工核酸酶；基因編輯技術；作物改良；專利；布局

對高等生物基因組進行高效、精確的定點改造是科學家多年來的研究目標，在該過程中發展出了多種提高基因組定點編輯效率的策略[1-2]。然而，只有在鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)代表的人工核酸酶介導的基因組編輯技術出現后，基因編輯技術在轉基因作物領域才有了實質性發展[3]。2015年8月，達沃斯世界經濟論壇發布了2015年度十大新興技術，其中包含了基因編輯技術，認為其是能夠改善農作物質量、減少各方爭議的突破性技術。人工核酸酶介導的基因組編輯技術是當前發展的熱點，包括：ZFN、大范圍核酸酶 (Meganuclease，MGN)、轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和基于成簇的規律間隔的短回重復序列的基因組編輯技術(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR)[4]。

在產業方面，TALEN技術的應用已經推進了基因編輯技術在作物改良領域的快速應用(鑒于使用基因編輯技術產生的作物是否為轉基因作物業界尚有爭議，該文將該應用領域統稱“作物改良”)[5-6]。美國公司Calyxt(原Cellectis Plant Science)利用TALEN技術研發了耐冷藏土豆和改善油品質的大豆，2015年11月，Calyxt宣布完成了改善油品質大豆的第2次田間試驗，以及耐冷藏土豆的第1次田間試驗。在TALEN技術發展的短短5年時間內取得如此成就，展現了基因編輯技術在作物改良方面的高效率。

基于對德溫特世界專利索引數據庫(Derwent world patents index database，DWPI)人工核酸酶技術在轉基因作物領域的應用專利樣本進行的檢索(檢索截止日期為2015年8月24日，樣本數量為429項專利申請文獻)，該文分析了全球范圍內人工核酸酶技術在作物改良領域的專利申請情況，揭示全球范圍內技術發展的趨勢、技術分布的區域、各技術方向發展的趨勢、主要申請人的專利布局情況，以及各技術方向對應的技術功效分布，以期為我國研究者的技術研發和專利布局提供參考。

1　時間趨勢

人工核酸酶介導的基因編輯作為一種安全、高效的基因編輯工具受到了國際農業組織、國際大型農業科技公司的重視，各大組織和公司在基因組學研究、作物遺傳改良等項目計劃中皆布局了不同技術方向的研究。

由圖1可知，在作物改良領域，人工核酸酶技術的應用呈現振蕩上升的趨勢，近年來在新技術的推動下發展尤為迅速。自20世紀末鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)和ZFN技術發展以來，該技術即在農業領域產生了一定的影響，形成了1999年的峰值，該階段的主要研發方向集中在新的ZFP蛋白發現、ZFP設計與篩選以及利用ZFP進行轉錄調控方面，但ZFN的設計與實現也在該時間段作出；自2004年Dana Carroll展示了ZFN技術在生物體應用后，其又在生物體內基因的原位編輯(NHEJ途徑)以及基因精確突變等方面掀起了新的增長，會同大范圍核酸酶在這一時期的發展促成了2004年后的增長趨勢；2010年之后，TALEN技術和CRISPR技術迅速崛起，在農業領域得到了較大關注，因此該領域申請量近年來迅速增長。

圖1　人工核酸酶技術全球時間趨勢Fig.1　The global temporal trend of designer nuclease technology

2　區域趨勢

2.1技術研發國分布在技術區域分布上，美國、中國和歐洲分列前3位。其中，ZFN、大范圍核酸酶以及TALEN技術的基礎突破分別由英國、法國和德國科學家完成，而CRISPR技術的基礎突破由歐洲科學家和美國科學家共同完成，可以看出歐洲在生物學的基礎研究上有著深厚的積淀。而上述四個技術方向應用方面的突破，除了大范圍核酸酶技術外，皆由美國科學家實現并由美國公司主導市場，反映出美國在技術產業化方面所具有的優勢。

2.2目標市場國分布由圖3可知，在人工核酸酶技術的目標市場國中，通過專利合作協定(Patent cooperation treaty,PCT)途徑和歐洲專利局(European patent office,EPO)途徑提出的分別排名第1和第3，表明這些申請進入多個國家，尋求區域全面性保護的需求，由于該技術領域的技術原創國主要是美國，因此體現了美國在人工核酸酶領域的“圈地運動”；而美國、歐洲、澳大利亞、中國和加拿大皆是轉基因產業較為關注的傳統市場。

圖2　全球人工核酸酶技術的區域分布Fig.2　The global distribution of designer nuclease technology

圖3　人工核酸酶技術全球目標市場國分布Fig.3　The global target market countries distribution of designer nuclease technology

3　技術分布及專利申請人情況分析

3.1技術方向分析由圖4可知，從各技術分支來看，大范圍核酸酶技術(MGN)發展最早，在1992年(最早優先權日)法國巴斯德研究所的申請即公開了大范圍核酸酶誘導雙鏈DNA斷裂的方法，可在供體DNA存在下通過同源重組途徑修復，并且指出了該技術在轉基因作物領域的應用前景，但該技術長期以來一直都未得到足夠重視，直至Cellectis公司成立，進一步在基因治療等領域深入發展該技術，使該技術在2007年達到高峰，但是大范圍核酸酶與其他人工核酸酶不同，其識別域和切割域并非分離的功能單元，存在設計和篩選困難的問題，因此在ZFN技術的壓制及TALEN技術和CRISPR技術的迅速發展下，近年來呈現下滑的趨勢。事實上，許多文獻未將該技術列入人工核酸酶領域，但其在人工核酸酶研究和產業方面有著重要的意義。

圖4　人工核酸酶技術分支發展時間趨勢Fig.4　The time trend of the branch development of designer nuclease technology

ZFN技術于1995年前后開始發展，此后由于3個方面的原因迅速發展：①大量鋅指蛋白結構的轉錄調控因子被發現；②MRC與SCRIPPS研究院等機構對鋅指蛋白設計與篩選方法的廣泛研究；③ZFN-FokI嵌合酶結構的提出。此后，由于Sangamo公司對該技術的壟斷，導致申請量有了一定下滑，但在Dana Carroll實現了該技術在生物體的應用后，ZFN技術又有了進一步的發展；由于Sangamo公司的壟斷、設計/篩選的難度以及新技術的興起，近年來也呈現了下降的趨勢，但在總量上依然處于優勢地位。

大范圍核酸酶技術由法國公司Cellectis推向市場，該公司1999年的成立得益于法國政府的支持。1999年，巴黎議會通過了新的“創新法案”，通過放松司法限制以及提供財務和稅務激勵等，鼓勵法國科學家創建起步公司。該法案涉及預算9.95億法郎(1.62億美元)，其中3.95億用于生命科學，包括生物技術[7]。受產業市場和資本市場的吸引，Cellectis公司在美國先后成立了Calyxt，Inc.(原Cellectis Plant Science)和Cellectis，Inc.兩個分支機構，前者專注于農業領域的應用，并對TALEN技術有所涉及，而后者主要專注基因治療。

TALEN技術發展于德國馬丁·路德大學(Martin-Luther University)的細菌學家烏拉·伯納斯(Ulla Bonas)對TAL效應因子(TAL effector，TALE)編碼的解析，Dan Voytas迅速將TAL識別域和FokI切割域嵌合形成人工核酸酶，并將其引入轉基因作物領域。由于其識別域TALE在設計篩選方面相比ZFP的明顯優點，因此自2010年后其熱度呈指數上升。Dan Voytas參與創立的Calyxt公司已經完成經TALEN技術改良的大豆和馬鈴薯的田間試驗。

RNA介導的、基于成簇的規律間隔的短回文重復序列和Cas蛋白的DNA核酸內切酶(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas)基因組編輯技術正式誕生于2012年，之后便迅速成為基因組編輯技術的代名詞，Dan Voytas迅速將其帶入轉基因作物領域，我國轉基因作物領域的研究人員對此也表現出濃厚的興趣。

3.2重要申請人分析由圖5可知，排名第1和第2的公司分別是致力于發展基因編輯技術的Cellectis和Sangamo，前者主要專注大范圍核酸酶技術開發，近年來在TALEN技術方向上發展迅速，而Sangamo公司則壟斷了ZFN技術。排名第1的Cellectis公司由André Choulika在法國研究部的資助下于1999年創立，致力于基于基因編輯的基因治療技術。其核心技術包括TALENTM產品和大范圍核酸酶技術，André Choulika最早發展了基于大范圍核酸酶對復雜基因組進行編輯的技術。Cellectis的子公司Calyxt，Inc.成立于2010年，位于明尼蘇達州。公司發展了用于提高作物質量的技術平臺，并與各大公司形成合作網，其中包括農業領域的拜爾、孟山都以及SESVanderhave等，制藥領域的Medicago公司和一些食品公司。排名第2的Sangamo公司致力于ZFN技術，其對ZFN技術的專利壟斷在產業界和科研界飽受爭議。

各大轉基因巨頭在人工核酸酶技術領域也皆有布局，但是在數量上并不突出，申請量最大的DOW公司也未超過30件。各公司專注的方向差異較大，DOW公司從Sangamo公司獲得ZFN獨家許可，在此基礎上發展了研發平臺；而Monsanto公司、BASF公司等從Cellectis公司和Precision公司獲得大范圍核酸酶技術的許可，在該技術方向上進行了一些布局。由表1可知，各大公司的技術方向布局，DOW公司對ZFN技術在轉基因作物領域的獨占許可表明了Sangamo公司對于ZFN技術的壟斷。

圖5　人工核酸酶技術主要申請人分析Fig.5　The analysis of principal applicants of designer nuclease technical

技術分類TechniquedistributionDOWBASFDUPONTMonsantoBayerSYNGENTAZFP1118207ZFN2700000MGN055062TALEN000220CRISPR001000

我國申請人創世紀轉基因公司和安徽省農業科學院分別排名第7和第10，表明我國產業界和學術界已經開始關注人工核酸酶技術方向，創世紀轉基因公司主要關注的方向是鋅指蛋白轉錄因子的發現，尚未真正進入人工核酸酶介導基因組編輯的領域；而安徽省農業科學院在TALEN技術與CRISPR技術應用于轉基因作物開發方面進行了很多有益的嘗試，主要工作是針對植物的內源基因進行靶向剪切，引發內源基因的NHEJ修復機制，造成內源基因的剪切從而敲除該基因，并獲得性狀改變的作物，植物的很多性狀受內源基因負向調節，因此該方法對開發新性狀的植物具有重要的意義。

3.3技術功效分析人工核酸酶可造成基因組在特異的位點產生DNA 雙鏈斷裂，從而激活非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)等DNA 修復機制。借此可對基因組DNA進行遺傳定點修飾，主要的方式有：NHEJ途徑介導的精確突變、同源重組介導的突變或插、區段刪除、連鎖疊加、轉錄調控[8]。人工核酸酶的另外一個應用是利用序列特異性，通過靶向轉錄因子的結合位點或產生合成轉錄因子的方法，調控內源基因的轉錄。

表2　各技術方向對基因的操作方式

從表2可知，最早發展的ZFN技術和MGN技術已經在基因操作的多個方面得到了應用，但NHEJ途徑仍然占據主導地位，而TALEN技術和CRISPR技術則主要集中在NHEJ途徑。事實上，目前4種人工核酸酶皆被大量用于通過NHEJ途徑對作物進行突變，該途徑雖然只能實現基因的敲除，但是對作物開發具有重要的意義。

對于較為復雜的精確基因編輯操作，例如HR突變、插入以及連鎖疊加方面，專利數量較少，表明在植物體內實現同源重組依然較為困難；區段刪除由于需要在植物體內同時表達至少兩組人工核酸酶，因此技術難度較大，目前能夠實現的作物和目標基因也較少。

鋅指蛋白和TALE被大量用于轉錄調節，與其分子結構的天然性質有關；對于ZFP而言，所涉及的大量申請為鋅指轉錄因子蛋白的發現及其序列解析，例如我國申請人創世紀種業的申請皆是該類型。

4　結語

4.1人工核酸酶技術在作物改良領域發展迅速該技術領域近年來發展迅速，許可活動密集，其中使用TALEN技術開發的作物已經完成田間試驗，并且其有望在全球范圍內取得寬松的監管，因此基因編輯是作物品種改良領域高效、安全技術的最新方向。

4.2人工核酸酶技術的發展方向TALEN技術與CRISPR技術是人工核酸酶技術的發展趨勢，在作物領域的應用也處于迅速發展期，我國轉基因作物領域的研發人員已經在TALEN與CRISPR技術應用方面取得一定突破，然而在專利布局層面卻沒有取得轉基因作物領域基礎應用的專利。

4.3作物改良領域的布局方向TALEN與CRISPR 在轉基因作物的應用目前集中于NHEJ途徑的基因敲除操作，在基因靶向突變或替換、基因插入以及基因刪除等方面仍然有大量可以布局的方向；此外，由于植物為多倍體，基因操作較為困難，因此提高操作效率的基因操作方法(包括獲取轉基因植株的方法)以及載體等工具方面也可以進行研發和布局。

4.4人工核酸酶的研發方向人工核酸酶的四個技術方向皆是基于對生物化學特定機制進行揭示和解析后獲得工具和方法，結構生物學在其中起著重要的作用，我國結構生物學的研究已經進入世界前沿，并且參與了人工核酸酶的發展，我國科學家應在深入基礎研究的同時，兼顧應用研究，發展最新的工具和方法；此外，應大力發展國際合作和人才引進，使得基礎研究和應用研究能夠把握最新的技術方向。

[1] MARIA L，CLAUDIA P，DAMIEN P，et al.Development of new biotechnologies in plant breeding[J].Nature biotechnology，2012，30(3)：231-239.

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Layout and Analysis of Worldwide Patents on the Designer Nuclease Technology of Crops Improvement

HE Xiang-qiong1, ZHAO Yong-jiang1, TAN Yong-hua2, PAN Wei-dong2*et al

(1. Patent Examination Cooperation Hubei Center of the Patent Office, SIPO, Wuhan, Hubei 430070; 2. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang, Guizhou 550002)

Based on the Derwent World Patents Index database (DWPI), the layout of worldwide patents on the designer nuclease technology of crops improvement was analyzed. The development trend of key technology, technique distribution area, situation about patent applicants and competitors, distribution of technical efficacy were revealed, so as to provide reference for technology research and development and patent layout of researchers in China.

Designer nuclease; Genome editing technique; Crop improvement; Patent; Layout

貴州省高層次創新人才培養計劃項目(黔科合人才[2016]4037)。

何湘瓊(1976- )，男，湖北鄂州人，副研究員，碩士，從事發明專利審查研究。*通訊作者，研究員，博士，從事天然農藥研究。

2016-06-17

N 18

A

0517-6611(2016)23-072-04