鼻黏膜外胚層間充質干細胞誘導分化成骨細胞的實驗分析

孫海寧　雷海鋒　王振清　趙詠梅陜西省銅川礦務局中心醫院耳鼻喉科，陜西銅川　727000

鼻黏膜外胚層間充質干細胞誘導分化成骨細胞的實驗分析

孫海寧雷海鋒王振清趙詠梅
陜西省銅川礦務局中心醫院耳鼻喉科，陜西銅川727000

目的 探討鼻黏膜外胚層間充質干細胞經誘導分化為成骨細胞的效果。方法 收集SD大鼠鼻黏膜，進行鼻黏膜外胚層間充質干細胞體外培養。對細胞表面標志物CD45-FITC、CD14-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD71-PE、CD34-PE、CD44-PE進行鑒定，并對細胞進行成骨誘導。成骨誘導分化后檢測細胞在不同時間的堿性磷酸酶活性變化情況，并對細胞進行茜素紅染色，觀察細胞誘導分化效果。結果大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞經成骨誘導分化后，堿性磷酸酶活性在誘導4 d后顯著增加，并在7 d達到最大值，之后逐漸下降。成骨誘導至21 d，對大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞進行茜素紅染色之后可觀察到結果呈現出陽性，細胞外基質中出現鈣沉積以及鈣結節形成。結論 在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚層間充質干細胞，該細胞具有分化潛能，經誘導分化可分化為成骨細胞，具有一定的臨床應用前景。

外胚層間充質干細胞；鼻黏膜；誘導；分化；成骨細胞

［Abstract］Objective To investigate the effect of the induction and differentiation of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa into osteoblast.Methods The nasal mucosa of SD rat was collected and the ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa were cultured in vitro.The cell surface markers CD45-FITC，CD14-PE，CD105-PE，CD34-PE，CD71-PE，CD34-PE，CD44-PE were identified，and the cells were taken osteogenic induction.After induction and differentiation of osteoblast，the changes of alkaline phosphatase activities in different time were detected，and the cells were taken alizarin red staining，the effects of induction and differentiation of cells were observed. Results Through induction and differentiation of osteoblast，the alkaline phosphatase activities of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa were increased significantly after induction for 4 d，which reached maximum value at 7 d and decreased gradually later.After osteogenic induction for 21 d，the ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa by alizarin red staining showed positive results，extracellular matrix showed calcium deposit and the formation of calcium nodule.Conclusion There are some ectomesenchymal stem cells′in the nasal mucosa of rats，the cells have the ability of differentiation and can be differentiated into osteoblasts through induction and differentiation，which has certain clinical application prospects.

［Key words］Ectomesenchymal stem cells；Nasal mucosa；Induction；Differentiation；Osteoblast

干細胞具有自我更新和自我分化能力，可以在一定的條件下分化為多種不同類型的細胞，應用于臨床各種疾病的治療之中［1］。外胚層來源的間充質干細胞是一種重要的干細胞類型，在一定的體外條件下也可以發生分化［2-3］。分化的細胞可以有多種類型，包括成骨細胞和脂肪細胞以及神經細胞等。其中，成骨細胞在臨床的應用十分廣泛。外胚層間充質干細胞主要存在于頭面部黏膜固有層中，其中，鼻黏膜是一個重要的細胞來源，可以分化為不同的細胞［4］。但是，關于鼻黏膜來源的外胚層間充質干細胞向成骨細胞的定向誘導及分化問題，相關的研究和報道較少。本研究探討鼻黏膜外胚層間充質干細胞經誘導分化為成骨細胞的效果，以期為臨床治療提供一定的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

納入SD大鼠5只，體重300 g左右，均為雄性，健康狀況良好。實驗動物均由濟南市金豐實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）2014-0006。本研究相關方案均提交醫院醫學倫理部門審核，并經批準，符合相關倫理學要求。

1.2方法

1.2.1大鼠鼻黏膜收集［5］對SD大鼠進行戊巴比妥鈉麻醉，達到麻醉效果之后處死。在超凈工作臺上剪下大鼠鼻道末端，收集1/3鼻中隔組織。將組織置于玻璃培養皿中，利用PBS進行3次洗滌，并對鼻中隔表面呼吸黏膜進行分離。

1.2.2大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞培養［6］對上述步驟采集到的呼吸黏膜進行處理，利用眼科剪剪為小碎塊，添加胰蛋白酶進行消化。置于37℃恒溫箱中消化5 min后取出，添加含有胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化。終止消化后進行離心，去掉上清，對細胞進行重懸，以1×106個/mL的濃度將細胞接種在培養瓶中，將培養瓶置入二氧化碳培養箱中進行常規原代和傳代培養。

1.2.3細胞免疫表型鑒定［7-8］倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，收集生長狀態良好的P3細胞，分別用PE或FITC偶聯的CD45-FITC、CD14-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD71-PE、CD34-PE、CD44-PE對細胞進行標記，上流式細胞儀進行細胞免疫表型檢測。

1.2.4大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞增殖情況檢測［9］利用MTT法對細胞的增殖情況進行檢測，收集P3細胞，胰蛋白酶消化之后制備細胞懸液，接種在96孔板中，添加完全培養基置于二氧化碳培養箱中進行培養。從接種后第1天起，每天取1板細胞，利用MTT法檢對細胞增殖情況進行檢測，使用酶聯免疫檢測儀檢測各孔的光吸收值（OD值），連續監測7 d。完成記錄數據，并利用數據描繪出細胞的體外增殖曲線。

1.2.5大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化［10］間充質干細胞傳至第3代，胰酶消化傳代，接種于6孔板，進行成骨誘導培養，誘導培養基含有β-甘油磷酸鈉和維生素C以及地塞米松，每3天更換1次培養基。

1.2.6大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導堿性磷酸酶的活性定量檢測［11］收集誘導后間充質干細胞，胰酶消化，接種在培養板上。觀察細胞融合情況，待達到100%之后利用對硝基苯棕櫚酸酯法對堿性磷酸酶的活性進行定量檢測，連續10 d，利用試劑盒進行檢測，記錄檢測結果。

1.2.7大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化細胞中鈣結節的形成檢測［12］大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導21 d后，去除培養液，PBS洗滌之后利用乙醇進行固定，去離子水輕柔沖洗后添加茜素紅染色液進行孵育。孵育結束吸除多余染色液，去離子水漂洗、振蕩，最后置于鏡下觀察、拍照。

1.3觀察指標

觀察細胞培養形態和表面標志物鑒定結果，并對成骨誘導分化后細胞在不同時間的堿性磷酸酶活性變化情況進行檢測。對細胞進行茜素紅染色，觀察細胞誘導分化效果。

2　結果

2.1實驗流程

實驗流程見圖1。

圖1　實驗流程

2.2大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞培養結果

接種后1 d，細胞開始發生貼壁，大多數細胞呈梭形或橢圓形（圖2A）。培養7 d，細胞大部分融合（圖2B）。傳經代培養，細胞大多呈梭形或橢圓形，且呈現出較為一致的排列方向（圖2C）。

2.3大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞鑒定結果

利用流式細胞儀對大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞表面抗原進行檢測，可得CD45、CD14、CD34、CD71均呈陰性表達，CD133、CD105、CD44均呈陽性表達。見表1。

表1　流式細胞儀檢測大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞表面抗原結果（%，x±s）

圖2　大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞培養結果（100×）

2.4大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞體外增殖曲線

MTT法檢測大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞不同時間OD值，描繪細胞增殖曲線，可得基本呈“S”型，1～3 d曲線平穩上升，細胞緩慢增殖，4 d開始曲線變得陡峭，細胞增殖速度明顯加快，之后持續上升，并于7 d開始下降。見圖3。

圖3　大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞體外增殖曲線

2.5大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化后堿性磷酸酶表達水平

大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化后堿性磷酸酶活性在誘導4 d后顯著增加，并在7 d達到最大值，之后逐漸下降。見圖4。

圖4　細胞成骨誘導分化后堿性磷酸酶表達水平變化情況

2.6大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化后鈣結節染色情況

成骨誘導至21 d，對大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞進行茜素紅染色之后可觀察到結果呈現出陽性，細胞外基質中出現鈣沉積以及鈣結節形成。見圖5。

圖5　大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞成骨誘導分化后鈣結節染色情況（茜素紅，200×）

3　討論

間充質干細胞具有很強的多向分化潛能和自我增殖能力，可以在一定條件下發生分化。趙紅斌等［13］報道，間充質干細胞可以向成骨細胞發生分化，且分化過程受到多種因素的影響，機械力可以通過Ca2+信號、細胞微絲結構以及PI3Ks信號途徑導致一定應答反應和生物學效應的出現，進而影響到細胞的成骨分化。間充質干細胞具有不同的類型，不同的細胞類型均有可能分化為成骨細胞。鞠曉東等［14］收集3周齡Lewis大鼠腹股溝脂肪墊進行培養，成功獲得脂肪間充質干細胞，并通過成骨誘導培養基培養，誘導細胞向成骨細胞方向發生分化。

外胚層間充質干細胞主要存在于頭面部黏膜固有層中，具有一定的分化潛能，在一定的條件下可定向分化為不同的細胞類型，包括神經細胞和成骨細胞以及脂肪細胞等，具有較高的臨床應用價值。以往王亦菁等［15］通過研究報道，牙髓干細胞、外胚間充質干細胞的細胞形態均與骨髓間充質干細胞十分相似，外胚間充質干細胞增殖能力較強，包含多種間充質類型細胞，有望成為臨床口腔頜面部間充質干細胞的重要來源。在鼻中隔黏膜組織中，大的部分均屬于呼吸黏膜，呼吸黏膜均起源于外胚層。在鼻黏膜中，可以獲得一定的干細胞，相應的干細胞可以在一定條件下分化為不同的細胞類型。張健等［16］收集大鼠鼻甲組織，經分離、培養獲得鼻黏膜來源干細胞，并利用成纖維細胞生長因子對細胞進行誘導，使之成功分化為施萬樣細胞。

本研究從SD大鼠鼻中隔收集呼吸黏膜，并通過體外培養，獲得實驗所需的外胚層間充質干細胞。對間充質干細胞進行鑒定的時候，常用的標志物包括CD133、CD105、CD44等。本研究結果顯示，利用流式細胞儀對大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞表面抗原進行檢測，CD133、CD105、CD44均呈陽性表達，提示相應的細胞為外胚層間充質干細胞。間充質干細胞具有很強的多項分化潛能，實際應用過程中，可以按照實際需要，對細胞進行一定的定向誘導，促進其向一定的方向發生分化，獲得所需細胞類型。在對鼻黏膜外胚層間充質干細胞進行成骨誘導的時候，本研究參考以往學者的方法［17］，制備所需的誘導培養基。培養基中含有多種成分，包括β-甘油磷酸鈉和維生素C以及地塞米松。其中，地塞米松可以對細胞各項活動予以有效的調節，維生素C可以參與到Ⅰ型膠原的早期合成環節之中，β-甘油磷酸鈉可以參與到細胞外基質的礦化過程中［18］。在觀察細胞成骨效果的過程中，可以選擇對一定的指標進行觀察。堿性磷酸酶是成骨細胞的一種重要組成成分，可以對參與骨代謝重要蛋白以及成骨細胞分化相關情況予以反映［19］。本研究結果顯示，大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞經成骨誘導分化后堿性磷酸酶活性在誘導4 d呈現出顯著增加的情況，并在7 d達到最大值，之后逐漸下降。即提示，在經過一定的成骨誘導之后，細胞向成骨細胞方向進行分化。另外，成骨細胞可以分泌堿性磷酸酶，導致磷酸局部水平的上升。堿性磷酸酶在細胞外基質中的大量分泌會對細胞外基質礦化過程產生積極的促進作用，使得鈣鹽大量沉積［20］。本研究發現，成骨誘導至21 d，對大鼠鼻黏膜外胚層間充質干細胞進行茜素紅染色之后可觀察到結果呈現出陽性，細胞外基質中出現鈣沉積以及鈣結節形成。這一結果也進一步證明，在經過一定的成骨誘導之后，鼠鼻黏膜間充質干細胞向成骨細胞分化。

綜上所述，通過本研究初步提示，在大鼠鼻黏膜中存在一定的外胚層間充質干細胞，該細胞具有分化潛能，可以經誘導分化為成骨細胞。另外，鼻黏膜取材方面，可以為臨床細胞培養提供豐富的材料來源。為此，鼻黏膜來源的外胚層間充質干細胞具有一定的臨床應用前景，關于其臨床應用效果，還有待在今后予以進一步的分析。

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Experimental analysis of the induction and differentiation of ectomesenchymal stem cells derived from nasal mucosa into osteoblast

SUN HainingLEI HaifengWANG ZhenqingZHAO Yongmei
Department of Ear-Nose-Throat，Central Hospital of Tongchuan Mining Bureau of Shaanxi Province，Shaanxi Province，Tongchuan727000，China

R329.2

A

1674-4721（2016）08（b）-0029-05

2016-04-03本文編輯：張瑜杰）