高效液相色譜法測(cè)定葵花籽中綠原酸的含量

賈國(guó)凱　徐　康　陳修文　陳小明*

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高效液相色譜法測(cè)定葵花籽中綠原酸的含量

賈國(guó)凱徐康陳修文陳小明*

（湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199）

目的：采用高效液相色譜法測(cè)定湖南永州葵花籽中綠原酸的含量。方法：高效液相色譜法，采用Inertsustain –C18( 250 mm×4.6 mm，5μm)為色譜柱，柱溫40℃，以乙腈(A)：0.4%磷酸( B)體積比為17:83做為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：綠原酸在10 min內(nèi)達(dá)到良好分離，線性范圍分別為0.3μg～3.3 μg(r = 0.9991, n = 5)；平均加樣回收率分別為92.7% ( RSD 0.43%)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便，快速，精確，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為葵花籽中綠原酸的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜；葵花籽；綠原酸

綠原酸在植物界廣泛存在，但含量較高的植物不多。國(guó)外多以咖啡豆和金銀花為原料提取綠原酸，我國(guó)葵花籽資源豐富，年產(chǎn)量達(dá)125萬(wàn)噸，它還是一種健康食品，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，葵花籽仁性甘寒，有潤(rùn)肺平肝、治血病，透癰膿之功效。現(xiàn)代研究表明，葵花籽中富含維生素E、酚酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)。經(jīng)常食用，有助于降低膽固醇、高血壓、高脂肪和有助于防治心腦血管疾病。但是，對(duì)于葵花籽中的綠原酸成分研究，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，為此，文章采用回流提取葵花籽中綠原酸成分，并采用高效液相色譜分析其含量，為進(jìn)一步開發(fā)葵花籽提供理論依據(jù)。

葵花籽是向日葵的果實(shí)。向日葵屬于菊科向日葵屬。為一年生草本植物。別名葵花，我國(guó)古籍上又叫西番蓮、丈菊、迎陽(yáng)花等，在歐洲叫太陽(yáng)花，還有些國(guó)家叫太陽(yáng)草、轉(zhuǎn)日蓮、朝陽(yáng)花等。葵花籽中含蛋白質(zhì)、糖類和檸檬酸、酒石酸、綠原酸等有機(jī)酸。綠原酸具有廣泛的生物活性，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個(gè)領(lǐng)域。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒[1]、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。

1　儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀(日本島津公司)，DAD 檢測(cè)器(日本島津公司)，島津色譜工作站；Waters 600 高效液相色譜儀，ELSD-2000 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器( Waters 600 美國(guó))，YAMATO 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本雅馬拓公司)；AE240 分析天平(賽得利斯)；XMTD-8222 鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DK-S 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；KQ-400DB 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司)。

葵花籽（湖南永州），綠原酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純（Fisher Scientific公司）；水為去離子水；其余所需化學(xué)試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取有殼與去殼葵花籽原料4.0g，按照料液比1：10，加入50mL的70%乙醇溶液，溫度80℃，回流提取2次，每次提取40min，進(jìn)行抽濾，合并兩次濾液[2]，濃縮至1mL~2mL，加甲醇溶液定容至50mL，備用。

2. 2 色譜條件

ODS-C18柱(4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相為乙腈與0.4%磷酸混合液(體積比為17∶83)，0.45 um濾膜抽濾；等梯度洗脫，流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm[3]。對(duì)照品綠原酸和葵花籽樣品分離的色譜圖見(jiàn)圖1。

A.綠原酸對(duì)照品溶液

B.葵花籽供試品溶液

圖1.綠原酸對(duì)照品（A）和樣品（B）色譜圖

2.2線性關(guān)系考察

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1.02mg，用甲醇定容至1mL配制成1.02mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各吸取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用甲醇定容至濃度為0.333mg/mL，0.200mg/mL，0.111mg/mL，0.059mg/mL，0.030mg/mL。在上述色譜條件下測(cè)定，分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣量10μL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸。繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 32547926.48x-129653.21說(shuō)明綠原酸的濃度與吸光度在0.333～0.030mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品綠原酸溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算綠原酸的RSD為0.96%，表明儀器精密度良好[4]。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一購(gòu)買的葵花籽樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得綠原酸的平均含量( n = 6) 分別為5.8mg/g ，RSD為0.68%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批葵花籽的供試品溶液，室溫密閉放置，分別在制備后0 h、4 h、8 h、12 h、24h 進(jìn)樣測(cè)定綠原酸峰面積，RSD( n = 6) 為2.1%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2. 6加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取葵花籽約4.0g，共5份，精密加入對(duì)照品溶液1. 5 mL[3]，按“2. 1”方法制備供試品液，分別按“2. 2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1.綠原酸回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Result of the recovery experiment of Chlorogenic Acid 成分樣品量/g綠原酸含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/% 綠原酸4.0122.2580.03322.28890.9 4.0522.4900.03322.52296.9 4.0322.3740.03322.40490.992.70.43 4.0322.3740.03322.40490.9 4.0122.2580.03322.28993.9

3　討　論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品綠原酸溶液和提取液，用UV-2800光度計(jì)進(jìn)行光譜分析，在波長(zhǎng)400nm～200 nm范圍進(jìn)行掃描，綠原酸在320nm附近有特征吸收峰，提取液在波長(zhǎng)400nm～200nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描3次，對(duì)掃描圖進(jìn)行峰檢，發(fā)現(xiàn)在327nm處分別有較強(qiáng)的吸收峰，故選定327nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾試過(guò)甲醇-水，乙腈-水溶液等為流動(dòng)相，分離效果均不理想，色譜峰拖尾嚴(yán)重，而采用乙腈-0.4%磷酸水溶液后分離效果有明顯的改善，且峰形均較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，故最后選擇乙腈-0.4% 磷酸水溶液為流動(dòng)相。

3.3提取方法確定

考察了60%甲醇，70%甲醇，100%甲醇，60%乙醇，70%乙醇，95%乙醇幾種不同提取溶劑，對(duì)葵花籽中綠原酸提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%提取效果最好且雜質(zhì)較少，對(duì)超聲提取法和加熱回流法的提取效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)回流提取法提取綠原酸優(yōu)于超聲提取，但提取物中雜質(zhì)較多，超聲提取綠原酸優(yōu)于回流提取。回流提取操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，易于平行獲取供試品液，故最終選擇回流提取方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典1部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2]張維農(nóng),劉大川,胡小泓.葵花籽仁中提取綠原酸的研究[J].中國(guó)油脂,2002,(2):76-77.

[3]薛曉麗,高效液相色譜法測(cè)金銀花中綠原酸的含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(2):296-297.

[4]劉圣金,狄留慶,吳德康,宋燕.高效液相色譜法測(cè)定杜仲中綠原酸的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2006,(1):44-45.

（責(zé)任編校：何俊華）

2016－05－19

永州市科技局項(xiàng)目－迷迭香鼠尾草酸的純化工藝及其應(yīng)用研究。

賈國(guó)凱（1987－），男，山西曲沃人，碩士研究生，研究方向?yàn)橛袡C(jī)合成。

陳小明（1983－），男，湖南永州人，工程師，碩士，研究方向?yàn)樗幬镄录夹g(shù)、新工藝與新制劑。

Ｏ621.3

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1673-2219（2016）10-0067-02