蘭州百合多糖硫酸酯的制備及其抗氧化活性的測定

黃玉龍，趙保堂，宋珅，李偉綺，龐中存，張繼*

（1.甘肅省農業科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；3.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

蘭州百合多糖硫酸酯的制備及其抗氧化活性的測定

黃玉龍1，2，3，趙保堂2，3，宋珅2，3，李偉綺1，龐中存1，張繼2，3*

（1.甘肅省農業科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070；3.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

從蘭州百合鱗莖中提取百合多糖（LPs），用氯磺酸-吡啶法制備百合多糖硫酸酯（LPsS）。以百合多糖硫酸酯的硫含量為評價指標，依據響應面設計對反應溫度、時間和酯化劑比例（氯磺酸∶吡啶）三個影響因素進行優化。得出最佳條件為反應時間1.5 h，反應溫度43℃，氯磺酸與吡啶的體積比為1∶1。在此條件下，百合多糖硫酸酯中硫含量可達到10.98%。傅里葉紅外光譜掃描顯示在波數1 236 cm-1、813 cm-1處出現新吸收峰，說明百合多糖已被硫酸化。氣質聯用（GC-MS）分析百合多糖硫酸酯由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3種單糖組成，其摩爾比為18：14：1。體外抗氧化活性試驗結果表明百合多糖硫酸酯具有較好的清除DPPH自由基能力，并且抗氧化活性比未酯化前有所提高。

蘭州百合；多糖；硫酸酯化；抗氧化活性

蘭州百合（Lilium davidii）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）川百合的一個變種，始載于《神農本草經》，列為中品，以后歷代本草均有記載［1］。蘭州百合含有蛋白質、多種維生素、總類胡蘿卜素、8種人體必需氨基酸和12種人體必需微量元素等成分［2］，其中總糖含量占13%，現代藥理學研究發現，百合多糖（Lilium davidiipolysaccharides，LPs）具有清除自由基、調節免疫、抗腫瘤、抗疲勞、抑菌等作用［3］。近年來對百合多糖的可能作用機制、提取條件優化、分離純化方面研究較多，但對其構效關系和生理活性機理的研究還不夠深入。

多糖分子修飾或功能化可提高其生物活性與生物相容性。多糖硫酸化修飾是用硫酸基團取代大分子鏈糖基單元的羥基，形成半合成酸性多糖，導致其物理化學性質和空間結構形貌發生改變，使某些活性較低或不具活性的多糖產生新活性［4］。如小分子質量的牛膝多糖具有增強免疫力作用而無抗病毒活性，在引入一定量的硫酸基團后，其抗乙肝病毒的活性增強；香菇多糖經硫酸化修飾后，其人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的活性也明顯增強［5-6］。研究百合多糖構效關系，對其進行結構修飾，有利于百合多糖的抗氧化、抗突變、抗病毒等藥理活性的增強［7-8］。

本研究采用氯磺酸-吡啶修飾工藝，對百合多糖進行修飾，制備百合多糖硫酸酯（Lilium davidiipolysaccharides sulfate，LPsS），采用氣質聯用（gas-chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）儀分析其單糖組成，并初步測定了其抗氧化活性，以期為蘭州百合高活性多糖的制備及其在食品醫藥行業的開發應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蘭州百合：蘭州金德百合商貿有限公司。

吡啶：天津市大茂化學試劑廠；氯磺酸、乙酸酐、無水乙醇：天津光復精細化工公司；甲酰胺、二甲基甲酰胺：天津市化學試劑一廠；三氟乙酸：上海晶純試劑公司；溴化鉀：Adamas試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：美國Sigma公司；標準單糖鼠李糖、來蘇糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖：北京索萊寶公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

DF-101B恒溫磁力攪拌器：浙江樂清市樂成電器廠；JRA-6型恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器公司；BSA224S型電子天平：德國賽多利斯公司；LGJ-18S冷凍干燥機：北京松源華興公司；EA3000型元素分析儀：意大利Euro Vector公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜（Fourier transforminfrared spectrum，FT-IR）儀、Polaris-Q氣相色譜質譜聯用儀：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3試驗方法

1.3.1LPs的制備［9］

稱取適量的蘭州百合，干燥后經100目篩粉碎，在50℃條件下超聲波輔助提取，抽濾后將濾液4 000 r/min離心15 min取上清，減壓濃縮，采用Sevage法脫蛋白，加入4倍體積無水乙醇沉淀24 h，4 000 r/min離心15 min，沉淀于-60℃冷凍干燥得到蘭州百合多糖。

1.3.2蘭州百合硫酸酯化多糖（LPsS）的制備

影響氯磺酸-吡啶方法制備LPsS的主要因素包括氯磺酸（chlorosulfonic acid，CSA）與吡啶（pyridine，Py）體積比、反應溫度及反應時間［10］。以硫含量（Y）為響應值，利用Box-Behnken設計了3因素3水平試驗，各Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.3硫含量測定

在氧化爐溫度980℃，載氣流速125 mL/min，載氣壓力80kPa，熱導檢測器與色譜柱溫度115℃，氧氣壓力50 kPa，加氧量20 mL條件下，分析時間320 s，采用元素分析儀測定硫含量（%）［11］。

1.3.4LPsS的FT-IR分析

將干燥充分的多糖樣品加溴化鉀（KBr）進行壓片，在400～4 000 cm-1波數范圍用紅外光譜儀掃描16次，分辨率為4 cm-1。

1.3.5LPsS的GC-MS分析

稱取10 mg LPsS加入4 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）4 mL，120℃條件下氮氣保護水解10 h后減壓蒸餾，去除三氟乙酸。添加0.5 mL吡啶及10 mg的鹽酸羥胺在90℃條件下反應0.5 h，待冷卻后再加入500 μL的乙酸酐，90℃條件下乙酰化反應0.5 h，減壓蒸干。

反應物經氯仿萃取，0.22 μm微孔濾膜過濾，進行GC-MS分析。

氣相色譜（GC）條件：TR-5ms SQC色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm），升溫條件為：從120℃（保持3 min）開始，以5℃/min升溫至250℃保持5 min。載氣為高純氦氣（He），柱流量為1.0 mL/min，分流比為1∶50，進樣口溫度250℃［12］，進樣量0.2 μL。

質譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250℃，四極桿150℃，掃描質量范圍為33～550 m/z，無溶劑延遲。

標準單糖和標品處理方法和色譜條件同上。

1.3.6LPs和LPsS對DPPH自由基清除能力的測定［13］

用蒸餾水分別準確配制質量濃度為5.0 mg/mL的LPs和LPsS溶液，使其溶解充分，并各自分別稀釋為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的溶液。配制DPPH溶液濃度為0.2 mmol/L。以丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）溶液作為陽性對照，其質量濃度與多糖溶液系列質量濃度相同。

以上配制的LPs、LPsS和BHT溶液分別量取2 mL，加入DPPH溶液0.5 mL后混勻，置于暗處0.5 h，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值Ai。量取不同質量濃度的LPs、LPsS和BHT溶液各2 mL，分別與相對應的溶劑各0.5 mL混合均勻后，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值Aj。量取DPPH溶液和蒸餾水各0.5 mL混合，在波長517 nm處以蒸餾水為對照測定吸光度值A0。DPPH自由基清除率計算公式如下：

2　結果與分析

2.1蘭州百合多糖硫酸化修飾的單因素試驗

2.1.1反應時間對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應溫度為40℃，CSA/Py 1∶1（V/V）的條件下，考察反應時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）對LPsS硫含量的影響，結果見圖1。

圖1　硫含量隨反應時間的影響變化Fig.1 Effect of reaction time on the sulfur content

由圖1可知，在反應時間0.5～1.5 h的范圍內，硫酸化反應時間與LPsS硫含量呈正相關；當反應時間為1.5 h時，硫含量最高，為10.22%；當反應時間＞1.5 h之后，隨著反應時間的延長，硫含量開始下降，該現象主要歸因于多糖與酯化試劑形成的多糖硫酸酯長時間在酸性環境中所發生的水解與多糖自身的降解［14］。因此，優化反應時間為1.5 h。

2.1.2反應溫度對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應時間為1.5 h、CSA/Py 1∶1（V/V）時，考察反應溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）對LPsS硫含量的影響，結果見圖2。

圖2　硫含量隨反應溫度的影響變化Fig.2 Effect of reaction temperature on the sulfur content

由圖2可知，硫含量在反應溫度30～40℃范圍內迅速升高；當反應溫度為40℃時，硫含量最高，為10.76%；當反應溫度＞40℃時，硫含量開始降低。這個結果表明，硫酸化反應宜在一個相對溫和條件下進行［15］。因此，選擇40℃作為最適反應溫度。

2.1.3氯磺酸與吡啶配比對百合多糖硫酸酯硫含量的影響

在反應時間為1.5 h、反應溫度為40℃的條件下，考察CSA/Py（1∶3、1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、3∶1）體積比對LPsS硫含量的影響，結果見圖3。

圖3　硫含量隨酯化劑配比的影響變化Fig.3 Effect of esterification reagent ratio on the sulfur content

由圖3可知，在CSA/Py為1∶3～1∶1（V/V）變化時，硫含量迅速升高；當CSA/Py為1∶1（V/V）時，LPsS硫含量最高，為10.45%；在CSA/Py為1∶1～3∶1（V/V）時，硫含量顯著下降。這是由于氯磺酸含量過高，反應體系處于強酸性條件下易產生板結，導致反應不均勻，降低硫酸化效果［16］。因此，選擇CSA/Py1∶1（V/V）為最佳。

2.2LPsS制備工藝的響應面法優化

2.2.1響應面法試驗結果

通過Box-Benhnhen試驗設計，對影響LPsS中硫含量（Y）的酯化劑配比（CSA/Py）、反應溫度和時間3個因素進行回歸分析，Box-Benhnhen試驗結果見表2。

表2　Box-Benhnhen試驗結果Table 2 Results of Box-Benhnhen experiments

2.2.2模型建立與方差分析

對表2的數據采用SAS分析軟件處理，得出回歸模型方程：Y=10.96+0.26X1+0.57X2+0.18X3+0.51X1X2-0.26X1X3+ 0.25X2X3-3.19X12-1.36X22-0.94X32，方差分析結果見表3。

表3　回歸模型的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression model

由表3可知，作用溫度X2與二次項X12、X22、X32都極其顯著（P＜0.01）；作用時間X1、酯化試劑比例X3及交互項X1X2、X2X3達到顯著水平（P＜0.05）。模型的復相關系數R2為0.995 7，說明模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型適合于模擬LPsS的硫含量。

2.2.3提取條件的響應面分析與優化

根據LPsS硫含量模型作出的響應面見圖4。

由圖4A可知，當CSA/Py為1∶1（V/V）時，LPsS硫含量隨反應溫度、反應時間的變化而變化。然而當溫度升高到一個臨界值時，硫含量開始緩慢減小。這和多糖硫酸酯的合成與水解有關，低溫不利于酯化反應進行，而高溫又會導致酯的水解，因此選擇一個適合的溫度，對于多糖硫酸化反應極為重要。由圖4B可知，LPsS硫含量隨反應時間的延長呈現出先增后減的趨勢，在特定的時間內，硫含量不會隨溫度的升高而增大，反應時間延長雖然有利于酯化，但強酸性條件下酯化時間過長，會使部分多糖水解；反應中CSA的含量少，酯化不完全，導致硫酸化多糖中的硫含量低。由圖4C可知，隨著反應溫度逐漸升高，酯化反應進一步增加，與此同時多糖的降解也隨溫度升高而加劇，因此，溫度過高、酸性太強均不利于LPsS的酯化反應進行。

圖4　CSA/Py、反應溫度及反應時間對百合多糖硫酸酯的硫含量影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between esterifying reagent ratio，reaction temperature and time on sulfur content of LPsS

2.2.4參數優化和模型驗證

從回歸模型的數學分析結果中得出的LPs硫酸化最優條件為：酯化劑（CSA/Py）體積比1∶1.07、反應溫度43.28℃、反應時間1.53h，硫含量預測值可達11.032%。采用最優工藝條件進行，考慮在實際生產和操作中的方便快捷，在驗證最佳參數的試驗中將參數值修訂為：酯化劑（CSA/Py）體積比1∶1、反應溫度43℃、反應時間1.5 h，重復3次，該條件下LPsS硫含量達到（10.98%±0.216）%，與預測值接近。所以該方案優化的LPsS制備最佳工藝參數具有應用參考價值。

2.3蘭州百合多糖硫酸酯的紅外光譜掃描

LPs和LPsS的紅外光譜掃描結果見圖5。

由圖5可知，LPs在波數為3426.38cm-1處為O-H伸縮振動，波數為1 053.14 cm-1處為一級O-H的變角振動，波數為2916.75cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動。LPsS圖譜顯示其多糖特征吸收未發生變化，而在波數為813 cm-1和1 236 cm-1處出現了新吸收峰。其中，波數為813 cm-1為C-O-S的伸縮振動，波數為1236cm-1為S=O的不對稱伸縮振動。另外，波數為2 927 cm-1處C-H吸收峰減弱，說明LPsS的-OH在一定程度上被取代。

圖5　百合多糖和百合多糖硫酸酯的紅外圖譜Fig.5 FT-IR spectrum of LPs and LPsS

2.4蘭州百合多糖硫酸酯的GC-MS分析

LPs和LPsS的水解衍生物GC-MS分析見圖6。

圖6　單糖混標（A），百合多糖（B）和百合多糖硫酸酯（C）的GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of monosaccharide mixed standard（A），LPs（B）and LPsS（C）analysis by GC-MS

由圖6可知，未修飾的百合多糖其單糖組成及摩爾比為甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=17∶15∶1；硫酸化修飾后百合多糖硫酸酯的單糖組成未發生改變，而其摩爾比變為甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=18∶14∶1，其修飾后的百合多糖摩爾比發生改變，主要是由于甘露糖與葡萄糖之間相互轉化導致的。

2.5LPs和LPsS清除DPPH自由基能力

由圖7可知，在0.02～2.00 mg/mL質量濃度范圍內，LPs和LPsS對DPPH自由基的清除能力隨質量濃度的增加而呈現增長趨勢。在該有效質量濃度范圍內，LPs糖鏈結構中引入了硫酸基，分子鏈的極性增強，黏度下降，溶解性增加，提高了糖鏈分子結合DPPH自由基的能力［12］，使LPsS對DPPH自由基的清除能力遠高于LPs，但低于陽性對照BHT。

圖7　LPs和LPsS清除DPPH自由基的能力Fig.7 Scavenging capacity of LPs and LPsS on DPPH free radical

3　結論

采用氯磺酸-吡啶方法，在單因素試驗基礎上進行響應面法優化，確定了蘭州百合多糖硫酸酯制備最優工藝條件：反應溫度43℃、反應時間1.5 h、酯化劑（氯磺酸：吡啶）體積比1∶1，該條件下可制備出硫含量可達10.98%的蘭州百合多糖酸酯。該制備方法條件溫和、簡便可行、修飾效果好、硫酸化多糖回收方便，適用于百合多糖的硫酸化修飾。

研究了蘭州百合多糖硫酸酯（LPsS）的單糖組成，與蘭州百合多糖（LPs）相比，其單糖組分未發生變化，但單糖摩爾比有所變化，甘露糖比例增加而葡萄糖比例降低。

LPs對DPPH自由基具有一定的清除能力，但經過硫酸化修飾所得的LPsS，對DPPH自由基的清除能力大幅提升。因此LPsS具有較好的抗氧化活性，具有一定的食品藥品行業功能性開發利用的價值。

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HUANG Yulong1，2，3，ZHAO Baotang2，3，SONG Shen2，3，LI Weiqi1，PANG Zhongcun1，ZHANG Ji2，3*
（1.Agricultural Product Storage and Processing Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China；3.Bioactive Products Engineering Research Center for Gansu Distinctive Plants，Lanzhou 730070，China）

Lily polysaccharide（LPs）was extracted from Lanzhou lily and lily polysaccharide sulfated（LPsS）was prepared by by chlorosulfonic acid-pyridine.Using the sulfur content in LPsS as evaluation indexes，based on response surface methodology（RSM），the combination of three factors：reaction temperature，time and esterification reagent ratio（chlorosulfonic acid：pyridine）were optimized.The optimum conditions were obtained as followed：reaction time 1.5 h，temperature 43℃and esterification reagent（chlorosulfonic acid：pyridine）ratio 1∶1（V/V）.Under the condition，the sulfur content in LPsS was up to 10.98%.The fourier transform-infrared spectrum（FT-IR）scanning showed that that new absorption peak appeared at 1 236 cm-1and 813 cm-1，which indicated that the sulfation was successful.Its monosaccharide composition was analysed by GC-MS，which showed that LPsS was composed of mannose，glucose and galactose，and the molar ratio was 18∶14∶1.Thein vitroantioxidant activity tests showed that LPsS had good scavenging capacity on DPPH·，and its antioxidant activity had improved than the unesterified ones before.

Lanzhou lily；polysaccharides；sulfation；antioxidant activity

O658

0254-5071（2016）06-0122-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.026

2016-03-10

國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B04）；甘肅省技術創新項目“蘭州百合產業能力提升關鍵技術的集成與示范”

黃玉龍（1980-），男，助理研究員，碩士，研究方向為農產品貯藏加工。

張繼（1963-），女，研究員，博士，研究方向為天然產物化學。