H PLC測(cè)定清平顆粒中人參皂苷Rg1的含量

石晶萍　洪麗萍

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)量管理部質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 泰州225321）

H PLC測(cè)定清平顆粒中人參皂苷Rg1的含量

石晶萍洪麗萍

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)量管理部質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 泰州225321）

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定清平顆粒中人參皂苷Rg1含量。方法：色譜柱為Agilent ZORBX Eclipse plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：人參皂苷Rg1在0.013 2～0.423 0 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=1.000 0；回收率：98.0%，RSD：0.3%。結(jié)論：該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可行，可用于清平顆粒中人參皂苷Rg1的定量分析。

高效液相色譜法；清平顆粒；人參皂苷Rg1；含量測(cè)定

清平顆粒（成分：羚羊角、赭石、石決明、鉤藤、菊花、地黃、女貞子、地龍、川牛膝、天南星（毒）、三七、黃芩、桃仁、玄參、石膏、槐花、薄荷腦）功能：滋陰潛陽(yáng)，化瘀通絡(luò)。用于陰虛陽(yáng)亢或肝陽(yáng)上亢型高血壓，有效改善頭痛、眩暈、心悸等癥狀。人參皂苷Rg1是其主成分三七的主要有效成分之一［1］，具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，具有促進(jìn)海馬神經(jīng)元突起生長(zhǎng)，提高神經(jīng)可塑性，增強(qiáng)學(xué)習(xí)能力與記憶力，抗衰老，抗疲勞，提高免疫力，輔助抗腫瘤，修復(fù)性功能等作用，在高端保健、輔助抗腫瘤、防治老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。其抗氧化作用、抑制NO合成及抑制辣椒素受體激活可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制［3］。

由于清平顆粒的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-5247（B-0247）-2014Z）含量測(cè)定主要測(cè)定清平顆粒的人參皂苷Rg1含量，所以本研究?jī)H針對(duì)清平顆粒中主活性成分之一人參皂苷Rg1定量檢測(cè)開展相關(guān)方法學(xué)研究。由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法是采用薄層掃描法，考慮到薄層掃描法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差，現(xiàn)在藥典已較少采用，為保證清平顆粒含量測(cè)定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究參考《中國(guó)藥典》（2015年版）［4］的高效液相色譜法（HPLC）的相關(guān)要求，對(duì)清平顆粒中人參皂苷Rg1含量測(cè)定的方法進(jìn)行了研究和方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可行，可用于人參皂苷Rg1的定量分析。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試藥和試液

清平顆 粒（批號(hào)：15010241，15010341，15010541，規(guī)格：12 g/袋）；人參皂苷 Rg1（批號(hào)：110703-201529，含量95.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供）；甲醇（批號(hào)：20130609）、正丁醇（批號(hào)：20131025）、氨水（批號(hào)：20131108），均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙腈（色譜純，批號(hào)：I729430409，Merck）。

2 儀器

美國(guó)安捷倫公司的Agilent 1200高效液相色譜儀和 Agilent 1260高效液相色譜儀，瑞士梅特勒公司Mettler Toledo XP205電子天平，昆山市超聲儀器有限公司的KQ-250B超聲儀，上海索普儀器公司的DZF-6050型真空干燥箱。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBXEclipseplusC18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相的比例見表1。

表1 流動(dòng)相比例

3.2 溶液配制方法

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備取人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得，對(duì)照品溶液色譜圖見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液HPLC圖

3.2.2 供試品溶液的制備取本品（批號(hào)：15010241）內(nèi)容物約 2.0 g，研細(xì)，精密加入甲醇50 mL，超聲（250 W，40 kHz）30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇層，再用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇層再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，合并正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得，供試品色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液HPLC圖

3.3 系統(tǒng)適用性、精密度、專屬性考察

樣品溶液準(zhǔn)備：按“3.2”項(xiàng)下方法配制人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液、供試品溶液，進(jìn)樣順序：空白溶劑（甲醇），人參皂苷 Rg1對(duì)照品溶液，供試品溶液，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。對(duì)照品與供試品理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算均不低于6 000，分離度大于1.5，系統(tǒng)適用性符合要求，結(jié)果見表2。

表2 系統(tǒng)適用性考察

3.4 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品11.13 mg，加甲醇制成濃度為0.423 mg/mL的對(duì)照品母液，逐級(jí)稀釋成濃度分別為 0.211 0，0.106 0，0.052 9，0.026 4，0.013 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品系列溶液各10 μL，由低濃度至高濃度進(jìn)樣。按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

以對(duì)照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3，表明人參皂苷Rg1在0.013 2～0.423 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 線性結(jié)果

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取批號(hào)為：15010341的清平顆粒6份，稱樣量分別為：1.998 1，2.001 4，2.001 1，2.006 4，1.997 2，2.009 8 g，按照“3.2.2”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算藥品中人參皂苷Rg1含量和RSD值，具體數(shù)值見表4。結(jié)果表明，供試品中人參皂苷 Rg1平均含量為 0.64 mg/g，RSD=1.4%，該方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對(duì)照品溶液：精密稱取人參皂苷 Rg1對(duì)照品13.00 mg，加甲醇制成濃度為0.012 mg/mL的加樣回收對(duì)照品溶液。

供試品溶液：采用加樣回收法，精密稱取9份已知含量同一批號(hào)的樣品（批號(hào)：15010341），稱樣量分別為：1.009 0，1.004 5，1.002 2，1.007 7，1.009 8，0.991 6，1.003 3，1.004 9，0.999 8 g；前3份樣品分別精密加入上述加樣回收對(duì)照品溶液25 mL，中間3份樣品分別精密加入上述加樣回收對(duì)照品溶液50 mL，后3份樣品分別精密加入上述加樣回收對(duì)照品溶液75 mL，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備。分別吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，按以下公式計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率 （%）=（實(shí)測(cè)人參皂苷Rg1質(zhì)量－樣品中人參皂苷Rg1質(zhì)量）/加入人參皂苷Rg1對(duì)照品質(zhì)量 ×100%。

結(jié)果表明，供試品中人參皂苷 Rg1平均回收率為98.0%，RSD=0.3%，該方法回收率良好。

3.7 中間精密度試驗(yàn)

另一位實(shí)驗(yàn)人員使用另一臺(tái)儀器，使用不同色譜柱Agilent ZORBX Eclipse plus C18（4.6 mm× 100 mm，3.5 μm），SN（序列號(hào)）：USUXR07971，精密稱取批號(hào)為 15010341的清平顆粒 6份，稱樣量分別為：2.003 1，2.003 6，2.005 1，2.006 5，2.001 5，2.004 9 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下的制備方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算藥品中人參皂苷Rg1含量、RSD；結(jié)果見表6，RSD為1.6%，表明該方法中間精密度良好，隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。

表6 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

在其他條件不變的情況下，分別改變?nèi)芤悍胖脮r(shí)間、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相比例，考察實(shí)驗(yàn)條件的微小變動(dòng)對(duì)結(jié)果的影響。

4.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取人參皂苷Rg111.91 mg，稱取批號(hào)為15010341的清平顆粒1.999 4 g，按照“2.1”項(xiàng)下溶液配制方法配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于配制后0，2，4，8，12，16，24 h進(jìn)行測(cè)定。

計(jì)算出對(duì)照品峰面積RSD為1.1%，供試品峰面積RSD為1.4%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，見表7。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

4.2 色譜條件改變

取批號(hào)為15010541的清平顆粒，在其他條件不變的情況下，分別改變柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速及流動(dòng)相比例，考察微小變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。試驗(yàn)結(jié)果見表8。

結(jié)果表明，測(cè)定條件有小的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果基本無(wú)影響。

表8 色譜條件微小變動(dòng)影響結(jié)果

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)清平顆粒中人參皂苷Rg1含量測(cè)定的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并通過(guò)改變?nèi)芤悍胖脮r(shí)間、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相比例后的試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，可以確定HPLC專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可行，可以用于清平顆粒中主活性成分人參皂苷Rg1的定量分析。

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Determination of Ginsenoside Rg1Content in Qingping Keli by HPLC

Shi Jingping，Hong Liping（Yangtz River Pharmacitical Group Co.，Ltd，Jiangsu Taizhou 225321，China）

Objective：To establish a HPLC method for determination of ginsenoside Rg1content in qingping keli. Methods：Separation was carried out on an Agilent ZORBX Eclipse plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）column using acetonitrile（A）-water（B）as mobile at a detection wavelength of 203 nm and a flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was 25℃ while the sample load was 10 μL.Results：The linear range of ginsenoside Rg1concentration was 0.013 2～ 0.423 0 mg/mL（r=1.000 0）.The average recovery of sample was 98.0%，with a RSD of 0.3%. Conclusion：This method is simple，accurate and feasible，which may be used for the quantitative determination of ginsenoside Rg1in qingping keli.

HPLC；Qingping Keli；Ginsenoside Rg1；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.09.006

2016-05-03）

洪麗萍，女，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：藥物分析和標(biāo)準(zhǔn)研究。通訊作者E-mail：hongliping@yangzijiang.com