電針對缺血再灌注大鼠腦內神經干細胞分化的影響①

王露露，林云嬌，吳潔，葉曉倩，黃佳，柳維林，陶靜，陳立典，4

·專題·

電針對缺血再灌注大鼠腦內神經干細胞分化的影響①

王露露1，2，3，林云嬌1，2，3，吳潔1，2，3，葉曉倩1，2，3，黃佳1，2，3，柳維林1，2，3，陶靜1，2，3，陳立典1，2，3，4

目的觀察電針對缺血再灌注大鼠神經干細胞分化的影響，探討電針發揮腦保護作用的可能機制。方法36只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術組（n=12）、模型組（n=12）和電針組（n=12）。模型組與電針組均按照改良Longa法制備左側大腦中動脈阻斷90min后再灌注模型。電針組行電針曲池、足三里干預21 d。電針后7 d、14 d、21 d行改良神經功能評分。電針后21 d小動物磁共振掃描儀T2WI觀察大鼠腦梗死體積；BrdU/Dcx、BrdU/NeuN免疫熒光觀察缺血側神經干細胞分化情況。結果電針后7 d、14 d、21 d，電針組神經功能評分差值高于同時間點模型組（P＜0.05）。電針后21 d，電針組腦梗死體積小于模型組（P＜0.05）；室管膜下區BrdU+/Dcx+細胞數顯著少于模型組（P＜0.001），缺血周圍皮質區BrdU+/NeuN+細胞數顯著多于模型組（P＜0.001）。結論電針曲池、足三里可以改善缺血再灌注大鼠神經功能缺損評分，減小腦梗死體積；可能與促進增殖的細胞向神經元分化有關。

腦缺血再灌注；電針；神經干細胞；分化；大鼠

［本文著錄格式］王露露，林云嬌，吳潔，等.電針對缺血再灌注大鼠腦內神經干細胞分化的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（9）:993-998.

CITED AS:Wang LL，Lin YJ，Wu J，et al.Effects of electroacupuncture on differentiation of neural stem cells after cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（9）:993-998.

神經干細胞（neuralstem cells，NSCs）是一群可以自我更新、增殖分化為其他類型如神經元、膠質細胞的細胞群［1］。腦內神經干細胞主要聚集在側腦室室管膜下區（subventricular zone，SVZ）與海馬顆粒下層區域（subgranular zone，SGZ）［2-3］。在這兩個區域內，神經干細胞可以自我增殖、分化、遷移/整合，相互交織形成神經網絡，發揮功能［4］。正常狀態下，腦內大部分神經干細胞受其所處的微環境影響處于休眠狀態［5］。各種內源性、外源性因素可激活神經干細胞，參與腦修復，其中缺血性腦卒中是常見的影響因素。大量研究表明，腦卒中后SVZ、SGZ的神經干細胞或前體細胞增殖，遷移至腦損傷周圍區，分化為神經元或膠質細胞，并整合進神經網絡中［6-8］。但真正分化為成熟神經元并整合進神經網絡的神經干細胞僅占0.2%，不足以修復腦損傷；尋找促進腦卒中后神經干細胞分化為新的神經元是有益的［9］。

針刺可以有效改善腦卒中患者功能障礙，改善其腦損傷［10-11］；電針可以促進腦卒中后損傷側神經干細胞增殖，分化為新的神經元和少突膠質細胞，發揮腦保護作用［12］。本團隊前期研究已證明，電針曲池、足三里穴干預缺血再灌注大鼠，可以改善損傷大鼠的神經功能，縮小腦梗死體積，促進神經干細胞增殖［13］。本實驗探討其對缺血再灌注損傷大鼠腦內神經干細胞分化的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組和處理

健康雄性清潔級Sprague-Daw ley大鼠36只，體質量（230±20）g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，生產許可證號SCXK（滬）2014-0002。在福建中醫藥大學實驗中心飼養，許可證號SYXK（閩）2013-0009。采用隨機數字法分為假手術組、模型組和電針組，每組12只。各組動物造模成功后3～15 d，腹腔注射10mg/m l BrdU示蹤劑50mg/kg（SIGMA公司），每天2次，間隔8 h。

所有操作均遵照國際動物保護和使用指南的規定實施。

1.2模型制備

模型組和電針組參照改良Longa法制作左側大腦中動脈阻斷模型（middle cerebral artery occlusion， MCAO）［14］。大鼠術前禁食不禁水12 h。腹腔注射10%水合氯醛3m l/kg麻醉，頸前正中切口，充分暴露并鈍性分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸總動脈近心端及頸外動脈靠近分叉處，夾閉頸內動脈。在頸總動脈結扎處附近剪一小口，將直徑0.25mm魚線從小口處插入頸總動脈。撤去頸內動脈血管夾，緩慢推動線栓使之從頸內動脈至顱腦內，感覺有少許阻力為止，固定線栓。縫合傷口，90min后回抽線栓。

假手術組僅分離動脈，不結扎、插線。

所有手術在室溫22℃下進行；室溫24℃下蘇醒。蘇醒后行Longa評分，將0分和5分的剔除。正常喂養。

1.3電針干預

電針組術后立即取患側曲池、足三里穴（大鼠穴位定位參考《實驗針灸學》），用30號0.5寸華佗牌不銹鋼毫針刺入3mm，接華佗牌G6805電針儀，電壓峰值6 V，疏密波，頻率1～20Hz。每次20min，每天1次，共21 d。

1.4神經功能評分

在電針干預前及干預后7 d、14 d、21 d，對所有大鼠進行改良神經功能缺損（modified Neurological Severity Scores，mNSS）評分，評分包括運動試驗、感覺試驗、平衡木檢測、感覺消失或異常活動。無異常記0分，中等異常1分，嚴重異常2分，總分18分。計算治療前后差值。

差值=各時間點評分-干預前評分

1.5MRI

采用小動物磁共振成像分析系統對大鼠進行T2wi掃描。大鼠3%異氟烷誘導麻醉5min，100μg/m l鹽酸美托嘧啶下肢肌肉注射0.5μl/kg麻醉。大鼠固定在掃描床上，0.2%異氟烷維持麻醉，頭部置于大鼠專用頭部表面線圈內，維持掃描環境穩定，使用SurgiVet V3395TPR動物生理檢測儀檢測大鼠體溫、血氧飽和度及呼吸、心率，維持實驗過程中生理狀態穩定。應用RARE技術顯示T2wi圖像：TE/TR 55 ms/4200 ms，FOV 32×32mm，層間距0，層厚0.8mm，矩陣256×256，翻轉角90°。掃描范圍參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為0點，從-5到15，連續21層。系統自動計算梗死體積。

1.6免疫熒光染色

所有動物腹主動脈采血后，經左心室生理鹽水灌洗，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定，取出腦組織，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，石蠟包埋切片。玻片微波修復后，5%胎牛血清封閉，室溫孵育1 h。BrdU染色封閉前，用2 mol/L HCl室溫孵育40 min，0.5mol/L硼酸清洗3次，每次5min；PBS清洗3次，每次5min。

滴加BrdU一抗（ab74547，ABCAM，1∶400）、NeuN一抗（ab177487，ABCAM，1∶200）、Dcx一抗（ab18723，ABCAM，1∶100），4℃過夜。PBS沖洗3次，每次5min，滴加熒光二抗，37℃避光孵育1 h；PBS清洗3次，每次5min。抗熒光淬滅處理及封片，封片劑風干后，立即用激光共聚焦顯微鏡（LEICA公司）200倍下觀察。每只取4張大腦梗死區切片，每張切片隨機取5個視野，計數陽性細胞數。

1.7統計學分析

2　結果

2.1mNSS

同時間點，模型組評分差值高于假手術組；電針組評分差值高于模型組（P＜0.05）。見表1。

2.2腦梗死體積

電針組梗死體積小于模型組（P＜0.05）。見表2、圖1。

2.3免疫熒光染色

假手術組SVZ區可見少量BrdU+/Dcx+細胞，缺血周圍皮質區沒有BrdU+/NeuN+細胞。電針組SVZ區BrdU+/Dcx+細胞數顯著少于模型組（P＜0.001）；缺血周圍皮質區BrdU+/NeuN+細胞數顯著多于模型組（P＜0.001）。見表2、圖2、圖3。

表1　各組mNSS評分差值比較

圖1　干預后21 d各組MRI T2wi

表2　各組干預后21 d梗死體積及免疫熒光染色結果比較

圖2　干預后21 d各組SVZ神經干細胞分化情況（BrdU/Dcx免疫熒光染色，200×）

圖3　干預后21 d各組皮質神經干細胞分化情況（BrdU/NeuN免疫熒光染色，200×）

3　討論

腦卒中在中醫學屬于“中風病”范疇，主要造成三陽經循行部位病變。治療中風多采用“治痿獨取陽明”的選穴原則。曲池、足三里屬手陽明大腸經和足陽明胃經，為該經合穴。現代臨床數據顯示，足三里和曲池在臨床治療腦卒中的穴位選擇中分別居于第一和第五位，在臨床應用廣泛。臨床試驗表明，電針曲池、足三里可以改善腦卒中后神經功能［10-11］。

本研究發現，電針曲池、足三里可以改善MCAO大鼠神經功能，減小腦梗死體積。這與團隊前期多篇研究結果一致［15-16］。電針可以減小皮質、紋狀體梗死范圍，發揮腦保護作用的效果在干預14 d時最明顯［17-18］。但也有研究發現，電針干預3 d內可以明顯促進MCAO大鼠神經功能恢復，減少梗死體積［19］。顏建勝等研究顯示，電針效果在前5 d最明顯［20］。結果的不同可能是由于電針不同穴位有關。

腦缺血在引起腦內神經元凋亡的同時，也激活腦內神經干細胞。研究表明，在腦缺血損傷的刺激下，神經干細胞分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元的數量達到正常狀態的2倍，在第14天達到頂峰，此神經發生過程可持續幾個月甚至一年［9］。此外，腦缺血可以促使一些非神經發生區，如皮質和紋狀體的神經干細胞分化。研究表明在缺血周圍區，來自SVZ的前體細胞約36%分化成星形膠質細胞，21%分化為成熟的神經元，超過40%新生神經元可以進一步分化為氨基酸能神經元等［21-22］。這些結果表明，神經干細胞參與腦缺血損傷的病理生理過程，與腦的自我修復可能有一定關系。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞S期可以標記DNA合成，為胞核表達活性物，標記細胞核，BrdU陽性細胞可被看作是具有增殖活性的細胞［23］。Dcx和NeuN分別是未成熟神經元和成熟神經元的標記物。本研究顯示，電針可促進腦缺血再灌注大鼠缺血側損傷周圍區神經干細胞分化為成熟神經元；未成熟神經元數少于模型組可能與電針縮短神經干細胞分化進程［24］有關。

除了皮質區，Gao等發現，電針曲池、足三里可促進海馬齒狀回90%新增殖細胞分化成神經元。而萬賽英等發現，電針能夠增強急性腦缺血梗死灶周圍膠質纖維酸性蛋白的表達，促進腦缺血區膠質血管單位重建，減輕缺血后腦損傷，表明電針不僅可促進神經干細胞向神經元分化，也可以促進其向膠質細胞分化［25］。

本研究顯示，電針可以促進腦卒中后腦神經功能修復，縮小腦梗死體積；這可能與其促進新增殖的細胞向神經元分化，并且縮短其分化進程有關。這些新增殖的神經元是否可以進一步整合進神經網絡并且發揮作用尚待研究。

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Effects of Electroacupuncture on Differentiation of Neural Stem Cells after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

WANG Lu-lu1，2，3，LIN Yun-jiao1，2，3，WU Jie1，2，3，YE Xiao-qian1，2，3，HUANG Jia1，2，3，LIUWei-lin1，2，3，TAO Jing1，2，3，CHEN Li-dian1，2，3，4
1.College of Rehabilitation Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350122，China；2.Technology Innovation Platform of Fujian Rehabilitation Industry Research Institute，Fuzhou，Fujian 350122，China；3.Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology，Fuzhou，Fujian 350122，China；4.Rehabilitation Research Center of Traditional Chinese Medicine，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou，Fujian 350122，China

CHEN Li-dian.E-mail:cld@fjtcm.edu.cn

Objective To explore the effectof electroacupuncture atQuchi（LI11），Zusanli（ST36）on differentiation of neural stem cells after cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods Thirty-sixmale Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group（n=12），modelgroup（n=12）and electroacupuncture group（n=12）.The latter two groupswere occluded the leftmiddle cerebralarteries for 90minutesand reperfused.The electroacupuncture group received electroacupuncture atQuchiand Zusanliacupoints for21 days.They were evaluated with modified Neurological Severity Scores 7，14 and 21 days after electroacupuncture.Their infarct volumes were tested with MRI T2WI 21 days after electroacupuncture，while the differentiation of neural stem cellswas observed with double-immunopositive BrdU/Dcx and BrdU/NeuN.Results Compared with themodel group，the neurological deficits score improved in the electroacupuncture group in all the time points（P＜0.05）.The infarctvolumes decreased in the electroacupuncture group（P＜0.05），with lessnumber of BrdU+/Dcx+cells in subventricular zone（P＜0.001）and more number of BrdU+/NeuN+cells in peri-infarct cortex（P＜0.001）21 days after electroacupuncture. Conclusion Electroacupuncture at Quchiand Zusanliacupoints can improve neurological function and decrease the infarct volumes in rats after cerebral ischemia-reperfusion，whichmay beassociatedwith promoting differentiation of neuralstem cells to neurons.

cerebral ischemia-reperfusion；electroacupuncture；neuralstem cell；differentiation；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.09.001

R743.3

A

1006-9771（2016）09-0993-06

2016-05-06

2016-07-19）

1.國家自然科學基金項目（No.81373778；No.81273835）；2.福建省衛生廳青年科研課題（No.2014-1-70）。

1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市350122；2.福建康復產業研究院技術創新平臺，福建福州市350122；3.福建省康復技術重點實驗室，福建福州市350122；4.國家中醫藥管理局中醫康復研究中心，福建福州市350122。作者簡介：王露露（1992-），女，江蘇南京市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復及認知科學。通訊作者：陳立典（1963-），男，福建政和市人，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：神經康復及認知科學。E-mail:cld@fjtcm.edu.cn。