動態監測血清caspase-3和NSE在新生兒缺氧缺血性腦病診治中的價值

郭映輝，李　梅，劉新光，閆　紅

(河北省兒童醫院檢驗科，河北 石家莊 050031)

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·論著·

動態監測血清caspase-3和NSE在新生兒缺氧缺血性腦病診治中的價值

郭映輝，李梅*，劉新光，閆紅

(河北省兒童醫院檢驗科，河北 石家莊 050031)

目的動態監測不同患病程度、不同病程階段缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopatly,HIE)新生兒半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)水平變化及臨床意義。方法隨機選取明確診斷為HIE的患兒67例，輕度HIE 23例，中度HIE 23例，重度HIE 21例，另選20例同期分娩正常足月的新生兒為對照組。各組新生兒均在出生后第1天、第3天和第7天采集股靜脈血，測定血清caspase-3和NSE水平的變化。結果各組caspase-3水平在第1天、第3天和第7天均呈先升高后降低的趨勢，但對照組升高和降低的幅度很小，而輕度HIE組、中度HIE組和重度HIE組升高和降低的幅度較大，病情越重波動越大；對照組和輕度HIE組NSE水平呈先升高后降低的趨勢，但中度HIE組和重度HIE組NSE水平呈逐漸下降趨勢；4組caspase-3和NSE水平組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.01)。結論caspase-3和NSE均參與了HIE的病理生理過程，其濃度水平與HIE患兒病情的輕重和病程進展有關，病情越重血清中2項指標水平越高。動態觀測2項指標變化趨勢，將有助于HIE的早期診斷、病情監測及判斷預后。

缺氧缺血，腦；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；神經元特異性烯醇化酶

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.019

[Abstract]ObjectiveTo dynamically observe caspase-3 and neuron specific enolase(NSE) of the neonate with the different stage of hypoxic ischemic encephalopathy and to explore the related significance. MethodsSixty-seven of children with hypoxic ischemic encephalopathy were randomly selected, in which mild, moderate and severe group were 23,23,21 respectively. Twenty neonates of full term normal were as control group. All the neonates in 1 day, 3 days, 7 days after their birth were taken blood to detect the serum levels of caspase-3 and NSE. ResultsCaspase-3 levels in each group showed a trend of increase in first days, third days and seventh days, but the amount of the increase and decrease in the control group was very small, while the change range was very big in the mild HIE group, moderate HIE group and severe HIE group, and the heavier the condition the greater the fluctuation. The level of NSE in the control group and the mild HIE group showed a trend of first increasing and then decreasing. But the NSE level of moderate HIE group and severe HIE group showed a gradual downward trend. There is significant difference between the groups ,the time points and their interaction(P<0.01). ConclusionBoth caspase-3 and NSE were involved in the pathophysiological process of HIE, the levels of caspase-3 and NSE were closely related to the severity and the course of HIE progression. The more severity of the HIE, the higher level of the two indicators. Dynamic monitoring of the caspase-3 and NSE will help the early diagnosis, disease monitoring and prognosis of the neonate HIE.

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)是指由于圍生期窒息、缺氧所導致的腦缺氧缺血性損害。HIE 的發生可能與母體及胎兒多因素有關[1]，圍產期缺氧是引起新生兒腦癱和腦損害的重要因素，其引起腦癱的發病率高達0.2%,并且會伴隨著整個生命過程，因此新生兒缺血缺氧性腦病應該引起重視。迄今為止，其診斷主要依靠病史、臨床表現和影像學檢查，有一定的局限性，不利于動態監測病情變化、提供及時治療及判斷預后，故選擇特異度和靈敏度高的指標判斷疾病的嚴重程度及指導臨床治療對新生兒HIE至關重要。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)是參與細胞凋亡的重要因子，神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)是存在于神經細胞和神經內分泌細胞的一種蛋白標志。本研究動態監測HIE患兒血清caspase-3和NSE水平，探討caspase-3和NSE在預測HIE患兒腦損傷程度和預后中的臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2008年6月—2009年12月我院新生兒科收治的HIE患兒67例。根據病情分為：輕度HIE組 23例，男性16例，女性7例，胎齡34～42周，平均(37.9±3.5)周，體質量(3.42±0.56) kg；中度HIE組23例，男性10例，女性13例，胎齡35～41周，平均(38.2±2.6)周，體質量(3.33±0.76) kg；重度HIE組21例，男性8例，女性11例，胎齡35～40周，平均(37.4±2.3)周，體質量(3.50±0.51) kg。均符合中華醫學會兒科學會新生兒學組于2004年11月在長沙修訂的新生兒HIE的診斷依據和臨床分度[2]。另選取我院同期分娩的正常足月新生兒20例為對照組，男性12例，女性8例，胎齡37～41周，平均(38.9±1.3)周，體質量(3.15±0.37) kg，均無窒息、感染、出血及神經系統疾病等病史。各組新生兒性別、胎齡、出生體質量差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法入院后HIE組分別在出生后1 d、3 d(急性期)和7 d(恢復期)，股靜脈穿刺采血5 mL，其中3 mL加入無熱源和內毒素的試管內，2 mL加入普通分離膠真空采血管，室溫下放置1 h， 3 000 r/min離心15 min。隨即分離血清，分裝于不同的帶蓋離心管內，-70 ℃保存備用。對照組分別在生后1 d、3 d、7 d采集股靜脈血，處理方法同前。caspase-3和NSE均采用酶聯免疫吸附測定法檢測，caspase-3試劑盒由美國Adlitteram Diagnostic Laboratories Inc提供，NSE試劑盒由北京北方生物技術研究所提供。

2　結　　果

各組caspase-3水平在第1天、第3天和第7天均呈先升高后降低的趨勢，但對照組升高和降低的幅度很小，而輕度HIE組、中度HIE組和重度HIE組升高和降低的幅度較大，病情越重波動越大；對照組和輕度HIE組NSE水平呈先升高后降低的趨勢，但中度HIE組和重度HIE組NSE水平呈逐漸下降趨勢；4組caspase-3 和NSE水平組間、時點間、組間·時間點交互作用差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表14組血清caspase-3和NSE水平比較

組別 例數Caspase-3第1天第3天第7天NSE第1天第3天第7天對照組 202.84±0.522.98±0.532.87±0.529.05±1.019.18±0.939.04±0.82輕度HIE組233.13±0.313.63±0.403.26±0.4511.75±3.6814.58±4.629.28±1.79中度HIE組235.79±0.647.36±1.573.79±0.6120.72±4.5516.98±6.0112.13±3.42重度HIE組216.86±1.029.54±1.435.25±0.7128.03±7.1222.35±5.4114.73±5.32組間 F=68.03 P=0.000F=23.656 P=0.000時點間 F=115.09 P=0.000F=122.341 P=0.000組間·時點間F=6.562 P=0.005F=8.951 P=0.004

3　討　　論

新生兒HIE是指新生兒圍產期窒息和缺氧造成的腦部缺血缺氧性損傷，主要引起神經元和腦白質損傷，影響新生兒大腦發育，其發生率達0.13%，其中15%～20%的HIE患兒會在出生后死亡，還有25%的HIE患兒將發展成為嚴重的、永久性的神經系統損傷[3]。另外，新生兒缺血缺氧還可以引起心肌的損傷，有研究表明HIE病情越重，心肌損害越嚴重[4]。HIE的發病過程十分復雜，是包括腦血流動力學變化、腦細胞能量代謝衰竭、遲發性神經元死亡、興奮性氨基酸的神經毒性作用、再灌注損傷及氧自由基作用等諸多因素參與的病理生理過程。目前有關HIE腦損傷的發病機制尚未完全明了。已有動物實驗表明，腦缺氧缺血后的細胞死亡可經歷2個階段：第一個階段為缺氧缺血期間，急性能量衰竭導致神經元與膠質細胞的變性、壞死；第二個階段為再灌注后遲發性神經元死亡。目前認為再灌注損傷在腦缺氧缺血損傷中起著更為重要的作用。新生兒HIE主要是通過細胞毒性、炎癥、氧化應激等引起腦細胞死亡，通常損傷發生在未成熟的大腦，可引起新生兒智力低下、發育遲緩，腦癱等嚴重疾病[5-6]。目前，對HIE發病機制的研究表明再灌注損傷在腦缺氧缺血損傷中起著重要的作用。再灌注之后，機體繼發一系列的代謝連鎖反應，釋放多種細胞因子參與其中[7-8]。同時，腦缺血時神經元細胞膜完整性破壞，細胞內大量蛋白質迅速進入細胞間隙，一些特殊蛋白的濃度也會有所變化[9-10]。

研究表明，一些生物分子參與了HIE的病理過程，如與細胞凋亡有關的caspase家族分子，caspase家族是其活性中心富含半胱氨酸的半胱氨酸蛋白酶家族，對底物天門冬氨酸有特異水解作用，與線蟲促凋亡基因編碼的CED-3蛋白具有高度同源性。該家族受到一定的信號刺激后通過蛋白酶級聯反應順序激活，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。迄今已發現該家族至少存在14個成員，其中caspase-3作為caspase級聯反應中最關鍵的效應酶，處于蛋白酶級聯反應的核心位置，被稱為死亡蛋白。它不僅是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路，也是凋亡的關鍵酶和執行者[11]。其具體作用有滅活細胞的Bcl-2和裂解細胞的蛋白質結構[12]。大部分腦損傷的表現形式為凋亡，腦缺氧缺血后caspase-3導致神經細胞凋亡，并參與缺氧缺血性神經元損傷的病理過程，故caspase-3在缺氧缺血性神經元死亡中發揮著重要作用。本研究結果顯示，caspase-3不僅與HIE病情密切相關，而且caspase-3水平隨著HIE病程變化而改變。說明HIE病情較重時，引起較多細胞發生凋亡，作為“死亡蛋白”觸發凋亡執行階段的caspase-3因子被更多的激活，導致更多神經細胞凋亡的發生。輕、中、重度組HIE患兒血清caspase-3水平在急性期均比1 d時高，恢復期HIE患兒血清caspase-3水平均較同組別急性期有所下降。因此，caspase-3與HIE病情密切相關，并伴隨病情發展而發生變化，可能為臨床HIE腦損傷的重要原因。動態觀測HIE患兒血清caspase-3的水平變化，有助于臨床監測HIE病情，有利于治療并判斷預后。

以往臨床上多采用腦電圖等方法評估神經系統損傷情況，但這些方法受干擾因素較多，可行性相對較差。而NSE是目前唯一能特異性反映神經元損傷的生化標志物[13]。NSE是糖酵解途徑的關鍵酶，是神經元和神經內分泌細胞所特有的一種酸性蛋白酶, 高濃度存在于神經細胞和神經內分泌細胞以及這些細胞所引發的腫瘤細胞中。朱濤等[14]研究表明NSE在小細胞肺癌中可持續陽性，對小細胞肺癌的診斷和治療有重要臨床意義。HIE新生兒發生缺氧缺血性損傷時，神經細胞和神經內分泌細胞膜的完整性破壞，血腦屏障損傷，NSE便從細胞內釋放出來，進入血液和腦脊液，故檢測血清中NSE的變化可反映腦組織損傷情況。臨床和動物實驗研究表明，大腦受損傷時神經細胞受到破壞，大量的NSE釋放到血液和腦脊液中。因此，早期檢測血清和腦脊液NSE水平可以提示神經系統早期損傷。有關手足口病患兒的研究表明，血清NSE水平的增高可反映神經系統的受損情況，且隨著病情的好轉，血清NSE水平逐漸降低，有助于判斷預后[15]。當癲癇、缺氧窒息等機體缺血缺氧狀態發生時，可繼發性引起神經組織損傷，從而引起NSE水平升高[16]。在急性烏頭堿中毒造成的腦損傷時，NSE水平急劇升高[17]。本研究結果顯示，新生兒HIE各組NSE水平均高于對照組，并且隨著病情加重，重度組高于中度組和輕度組，中度組高于輕度組，差異均有統計學意義(P<0.05)。說明NSE與HIE病情輕重有關，病情越重血清NSE水平越高?？赡苁侵?、重度HIE時除了有原發性腦損傷外，還有由于腦組織嚴重缺血缺氧造成的神經細胞缺氧，在嚴重缺氧情況下，神經細胞損傷釋放大量NSE,腦組織以糖酵解獲得能量，釋放出大量乳酸，引起酸中毒，進而形成繼發性的腦損傷。本研究結果還表明，輕度HIE組在出生后第3天血清NSE水平高于第1天血清NSE水平，而恢復期即第7天血清NSE水平與第3天相比有所下降，差異有統計學意義；而中度HIE組和重度HIE組在出生后第1天、第3天和第7天血清NSE水平呈逐漸下降趨勢，說明NSE在疾病早期明顯升高，但隨著治療的有效進行，NSE呈現明顯下降趨勢。因此，NSE在評估HIE治療效果方面較有價值。

綜上所述，動態監測HIE患兒血清caspase-3和NSE水平，不僅可以了解HIE患兒腦損傷程度，還可以評估HIE患兒治療情況，判斷HIE患兒預后，有重要的臨床意義。

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(本文編輯：許卓文)

The value of dynamic monitoring on caspase-3 and NSE in the diagnosis and treatment of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy

GUO Ying-hui, LI Mei*, LIU Xin-guang， YAN Hong

(Department of Laboratory Children′s Hospital of Hebei province, Shijiazhuang 050031, China)

hypoxia-ischemia, brain；caspase 3； neuron specific enolase

2016-08-19；

2016-09-11

河北省醫學科學研究重點課題(20110232)

郭映輝(1974-)，女，河北邢臺人，河北省兒童醫院

。E-mail:limeijulu@163.com

R743.1

A

1007-3205(2016)09-1069-04

副主任技師，醫學碩士，從事臨床檢驗學研究。