基于ITS序列的楊柳樹親緣關系分析

韓志校，張軍，韓孟迪，李洋，任亞超

（1.河北農業大學，河北保定 071000；2.河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊 050051；3.河北省殘疾人聯合會，河北石家莊 050081）

基于ITS序列的楊柳樹親緣關系分析

韓志校1，張軍1，韓孟迪2，李洋3，任亞超1

（1.河北農業大學，河北保定 071000；2.河北出入境檢驗檢疫局，河北石家莊 050051；3.河北省殘疾人聯合會，河北石家莊 050081）

該文以12個楊樹無性系和4個柳樹無性系為研究對象，利用MEGA5.0軟件分析了16個無性系ITS序列平均總長度為663bp,其ITS序列區的各堿基含量為：A所占比例在17.14%～17.81%，T所占比例在16.79%～18.05%，G所占比例在31.93%～32.73%，C所占比例在31.89%～33.43%，G+C所占的比例在64.36%～65.66%，其中G+C含量最高的是小葉楊，最低的是窄冠。同時用鄰接法構建了楊柳的系統進化樹，其結果可以反映各無性系間的親緣關系，表明ITS技術鑒定分析楊柳無性系植株是可行的。

楊樹；柳樹；TIS序列；鄰接法；親緣關系

楊樹和柳樹分別屬于楊柳科（Salicaceae）的楊屬（Populus）和柳屬（Salix），都為落葉樹種，是我國重要的闊葉樹種，也是防護林、水土保持林、風景林及用材林的重要組成樹種，具有較高的生態與經濟價值[1-5]。長久以來，楊樹和柳樹以其種類多樣，無性繁殖與種內雜交均容易發生[6-7]，且種間多態性豐富的優點使其在林木遺傳與改良學上具有較高的研究價值，深受人們的重視。

ITS即核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS），它位于18S和26S rDNA基因之間，并且被5.8S rDNA基因分為2段，即ITS1和ITS2。植物的rDNA是高度重復的串聯序列，它作為一個轉錄單位有多個拷貝[8-9]。在不同的植物中ITS區的變異情況不同，其中被子植物ITS序列的變異長度較短，能夠準確的反應植物的位點信息及其變異情況，實驗操作簡單易行，是目前在被子植物類群系統與進化研究中應用較為廣泛的一種標記技術[10]。在楊屬植物中，史良全[11-12]、王明福[13]等用ITS標記方法對楊屬植物進行了親緣關系分析，而對于柳屬植物的ITS研究較少，大多在研究楊屬植物ITS時，將柳屬植物做為外組群輔助對楊屬的研究。

試驗以12個楊樹無性系和4個柳樹無性系為試驗材料，利用ITS技術對其進行堿基替換、堿基組成和遺傳距離分析，并構建16個無性系的系統發育樹，旨在從分子水平探討楊柳的親緣關系，豐富對楊柳的研究，為楊柳樹的遺傳改良提供科學依據。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

試驗包括12個楊樹無性系和4個柳樹無性系。楊樹包含白楊派的5個無性系、黑楊派的3個無性系和青楊派的4個無性系，柳樹為垂柳（雌）、龍爪柳、沙柳和旱柳的4個無性系（見表1）。

表1 楊樹和柳樹試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

采用CTAB法提取樣品DNA，將DNA稀釋到80ng/μL，并將其放置在4℃冰箱保存。

1.2.2 引物

試驗引物來源于文獻[11-12]，其正反引物序列為5′_CGT AAC AAGGTTTCC GTA GC_3′，5′_TCC TCC GCTTATTGATATGC_3′，測序用引物除了擴增雙鏈模板所用正、反向引物外，補充位于5.8s上的中間引物2條（5'-GCTACGTTCTTCATCGAGC-3'，5'-GCATCGATGAAGAACGTAGC-3'），以保證測序的準確性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反應體系和擴增程序

﹙1﹚PCR反應。采用20μL體系，其中含2×Taq MasterMix 10μL，Forward primer 1μL，Reverse primer 1μL，Template DNA 2μL，Rnase-Free Water 6μL。

（2）PCR擴增程序。PCR擴增95℃預變性5min后，開始94℃變性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，30個循環，最后一個循環結束，然后72℃延伸7min，4℃保存20min，得擴增產物。

1.2.4 PCR擴增產物的處理

將擴增好的PCR產物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并拍照記錄條帶，同時，將條帶亮度高且只有單一條帶的，用小刀片輕輕切下裝入離心管，送至北京華大基因生物有限公司完成測序。

1.2.5 數據處理與分析

將返回的序列及其峰圖進行觀察并導出序列加以分析，將序列在MEGA5.0軟件上進行成對對比（ClustalW），同時對兩端缺失的序列進行刪除操作，分析堿基替換、堿基組成和遺傳距離等，并用鄰接法（Neighbor-joining）構建這16個無性系的系統發育樹。

2　結果與分析

2.1 PCR擴增效果檢測

將擴增好的PCR產物，在瓊脂糖凝膠電泳上做電泳檢測后，得到各樣品的擴增片段大小在750bp左右，擴增條帶單一無雜帶且條帶亮度很高，即擴增片段特異性較高，符合測序要求（見圖1）。

圖1 楊樹ITS擴增的譜帶

2.2 楊柳序列分析

通過對16個楊柳無性系的堿基序列分析，楊柳各無性系間的ITS序列較為相近，在645～669bp之間。在楊柳樣本中，都存在不同程度的堿基缺失情況（見表2），在楊屬植物中，廊坊楊缺失1個堿基，窄冠、丹紅楊、巨霸楊、小葉楊缺失2個堿基，易縣毛白楊、84K楊和北林1號缺失3個堿基，青楊和大青楊、朝鮮楊缺失的堿基較多，分別缺失10個和11個堿基，使得其序列相對于其他序列而言較短。在柳屬植物樣本中，序列長度在662～666bp之間，序列長度變化范圍較小，沙柳缺失2個堿基，垂柳（雌）和龍爪柳都缺失5個堿基，旱柳缺失6個堿基，這4個樣本的堿基缺少數變化范圍較小。

在楊屬植物中，ITS序列A所占比例為17.14% ～17.81%，平均值為17.50%；T所占比例為16.79%～ 18.05%，平均值為17.43%；G所占比例為31.93%～ 32.73%，平均值為32.35%；C所在比例為31.89%～ 33.43%，平均值為32.68%。G+C所占的比例為64.36%～65.66%，平均值為64.99%，在12個楊樹無性系中G+C含量最高的是小葉楊，達到了65.66%， G+C含量最低的是窄冠，為64.36%。在柳屬植物中，ITS序列A所占比例為17.80%～18.09%，平均值為17.90%；T所占比例為17.04%～18.47%，平均值為17.56%；G所占比例為31.38%～32.13%，平均值為31.88%；C所占比例為32.13%～33.03%，平均值為32.63%。G+C所占的比例為63.51%～65.16%，平均值為64.51%，在4個柳樹無性系中G+C含量最高的是旱柳，達到了65.16%，最低的是沙柳，為63.51%。

2.3 鄰接法構建楊柳的系統發育圖

試驗用MEGA5.0軟件中的鄰接法構建鄰接樹（Neighbor-joining tree），并對楊柳植物樣本進行了ITS序列分析。NJ法（Neighbor-joining method，NJ）主要是通過確定距離最近或相鄰的成對分類單位來使系統樹的總長達到盡可能的小。本試驗所用的鄰接法是將Tamura 3-parameter model［d：Transitions+Transversions；Gamma Distributed（G），Gamma parameter=5］作為進化距離參數的模型，1000次重復抽樣檢驗并以靴帶率（Bootstrap rate）來表示各分支的支持率，得到楊柳資源的系統進化樹（圖2），其中得到的進化樹的樹枝總長為0.043。

表2 ITS序列長度、GC含量及各堿基含量

圖2 基于rDNA ITS序列采用鄰接法獲得的楊柳樹系統發育樹

通過對系統發育樹觀察分析得到，整個系統發育樹可以分為兩大支，即楊樹無性系為一支，柳樹無性系為一支。在楊樹無性系中，又可以分為3個分支，5個白楊派無性系為一個分支、3個青楊派無性系為一個分支，最后一個分支是3個黑楊派無性系和青楊派的小葉楊，其中青楊派和黑楊派的無性系又聚在了一起，表明兩派之間的親緣關系較近。在柳樹資源中沙柳單獨聚為了一支，其余3個無性系聚在了一起。

在NJ圖中，16個樣品分為兩大支，分別為楊屬植物一支，柳屬植物一支。在楊屬植物中，黑楊派、青楊派和白楊派以100%的支持率聚在了一起，青楊派與黑楊派以94%的支持率聚為了一類，朝鮮楊和大青楊的支持率為36%，低于50%，其余樣品之間的支持率都大于50%。在柳屬資源中，垂柳、旱柳、龍爪柳聚為了一類，沙柳再與之聚在一起，它們之間的支持率都大于50%。

3　討論

隨著生物技術的不斷發展，ITS分子標記方法得到了廣泛的應用，其主要是與細胞學、一般分子標記等方法相結合來確定生物種起源、進化方向及與其他類群的關系等方面[14]。本文對16個楊柳無性系的系統發育樹進行了構建，其結果能較好的展現楊屬和柳屬各自無性系在系統中的進化關系和親緣關系，表明ITS可以應用于楊柳系統發育研究中。

在楊屬植物聚類中，白楊派無性系單獨成為一個分支，而黑楊派無性系與青楊派無性系形成另一個分支，結果說明白楊派無性系相對于其他派無性系比較原始，親緣關系較遠，黑楊派與青楊派無性系關系較近。這也與trnL-F[15-16]、分子標記[17-18]等其他生物技術方法得到的結果一致。本文中，青楊派的小葉楊與黑楊派無性系聚為了一類，而育種實踐也證明了小葉楊與黑楊派無性系的親緣關系較近，親和力較強，易于產生雜交后代。白楊派作為楊屬的一個原始分支，被認為是單系起源。本文通過利用ITS序列構建的系統發育樹分析結果，同樣證明了白楊派是單系起源，但在傳統白楊派分為白楊和山楊兩個亞派上，本文結果未能很好的區分，窄冠毛白楊與山楊以84%的支持率聚為了一類。

在柳屬植物聚類中，劉明航等[19]認為垂柳、旱柳、龍爪柳為種內變異水平，應該為一個種。本文對柳屬無性系的聚類分析與之一致，說明三者親緣關系較近。從系統發育樹可以看出，沙柳與垂柳、旱柳、龍爪柳分為了兩支，且支持率為100%，沙柳為筐柳組，其余3個為柳組，說明ITS標記方法可以作為鑒定柳屬植物的方法。

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Analysed the Genetic Relationship of Populus and Salix by ITS

HAN Zhi-xiao1,ZHANG Jun1,HAN Meng-di2,Li Yang3,REN Ya-chao1
（1.Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;2.Hebei Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,ShiJiazhuang, 050051，China;3.Hebei Disabled Persons，Federation,ShiJiazhuang,050081，China）

In this paper,12 poplar clones and 4 willow clones are analysed by the software of MEGA5.0.In the study,12 populus clones and 4 salix clones′length of ITS region sequence is 663.0bp in average.According to these samples in ITS region sequence,the base frequencies remains different in different species,the proportion of A between 17.14%～17.81%,the proportion of T between 16.79%～18.05%,the proportion of G between 31.93%～32.73%,the proportion of C between 31.89%～ 33.43%,the content of G+C is from 64.36%（zhaiguan）to 65.66%（Populus simonii Carr.）.Populus and Salix were constructed phylogenetic tree using Neighbor-Joining and the results may reflect the genetic relationship between all clons,and so it is feasible to identify and analyze the resources of populus and salix by ITS.

Populus；Salix；ITS；NJ

S718.49

A

1002-3356（2016）01-0023-04

2015-12-13

國家林業局項目“木本植物品種DNA分子圖譜研究”資助。

韓志校（1987-），女，河北石家莊人，碩士研究生，河北農業大學國有資產管理處實驗室管理科，主要從事實驗室管理工作。E-mail:hzx19870517@126.com。

張軍（1979-），男，河北石家莊人，講師，博士，河北農業大學林學院，主要從事林木遺傳育種工作。E-mail: zhangjunem@126.com。