胃癌細胞SGC7901凋亡的PI3K/Akt通路介導作用及雷帕霉素的作用機制分析

宋仕茂　陳宇　張治國　駱志國

湖北醫藥學院附屬太和醫院腫瘤科，湖北十堰442000

胃癌細胞SGC7901凋亡的PI3K/Akt通路介導作用及雷帕霉素的作用機制分析

宋仕茂#陳宇張治國駱志國

湖北醫藥學院附屬太和醫院腫瘤科，湖北十堰442000

目的分析雷帕霉素對胃癌細胞中PI3K/Akt蛋白表達的影響作用，以為臨床治療提供參考。方法將生長狀態良好的胃癌細胞SGC7901隨機分為4組：對照組，雷帕霉素低劑量組、中劑量、高劑量組（n=8）。采用DAPI染色法分析各組細胞的凋亡情況；采用免疫印跡法和Real-time PCR檢測PI3K/AKT信號通路中相關蛋白PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表達。結果雷帕霉素低、中、高劑量組均可抑制細胞的增殖，差異具有統計學意義（P＜0.05）；雷帕霉素下調了胃癌細胞中PI3K、AKT、mTOR蛋白及mRNA的表達，且與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發揮腫瘤抑制作用。

細胞凋亡；PI3K/AKT信號通路；雷帕霉素；免疫印跡法

Oncol Prog，2016，14（6）

胃癌是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的生活質量［1-3］。但目前對胃癌的治療尚無十分有效的方法，而且其確切的發病機制也尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路參與了腫瘤的增殖、分化及凋亡等過程，與人類腫瘤的發生發展密切相關，并且參與了腫瘤的遷移、黏附以及血管生成過程［4-6］。以該信號通路為靶點的小分子藥物有望成為腫瘤藥物開發的新思路。雷帕霉素為大環內酯類免疫抑制劑，通過作用于細胞因子受體阻斷多種信號通路的轉導，降低細胞周期依賴性激酶和蛋白激酶復合物活性，阻斷T淋巴細胞由G1期向S期的轉化［7-9］。本研究分析胃癌細胞SGC7901增殖過程與PI3K/AKT信號通路的關系，并探討雷帕霉素在此過程中的參與作用。

1　材料與方法

1.1材料

胃癌細胞SGC7901購自上海細胞所，并由本實驗室保存；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液購自美國Sigma Aldrich公司；AKT及mTOR抗體購自美國Abcam公司；PI3K抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司；PBS磷酸緩沖液購自天根生物；SGC7901細胞培養基購自Gibco公司；細胞培養板購自Gibco公司；離心機購自德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；蛋白垂直電泳槽購自美國Bio Rad公司；酶標儀購自美國Biotec公司；移液器為德國Eppendorf公司產品。其余試劑為市售分析純產品。

1.2方法

1.2.14'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色各組細胞爬片培養利用去甲基化藥物處理后，將制好的玻片上滴加DAP（I100 ng/ml）染液，染色10 min，流水沖去染液，濾紙吸除多余水分，加一滴熒光封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，激發波長360～400 nm。

1.2.2細胞計數試劑盒8檢測法分析細胞活性將培養好的胃癌SGC7901細胞接種至96孔Costa細胞培養板中，置于細胞培養箱中（37℃、5%二氧化碳，飽和濕度）進行培養。將培養好的細胞完全隨機分組（n=8），在各組中加入相應藥物孵育（對照組細胞給予溶劑DMSO處理；雷帕霉素低劑量、中劑量和高劑量組細胞給予的藥物濃度分別為1 μM、10 μM和100 μM），并于不同時間點取樣（0/6/12/ 24/48 h），棄去培養液用冰的無菌PBS充分沖洗，并加入MTT溫孵240 min。然后在每個培養孔中加入DMSO進行振蕩溶解，檢測各組細胞的吸光度，并計算細胞的抑制率。細胞抑制率=100%-（對照組吸光度-試驗組吸光度）/對照組吸光度× 100%。

1.2.3免疫印跡法檢測蛋白表達總蛋白提取方法均嚴格按照說明書進行。雙縮脲法進行總蛋白定量后，以等量蛋白進行垂直SDS-PAGE和半干法轉膜。轉至硝酸纖維素膜上后以5.0%脫脂牛奶封閉，然后與一抗溫孵4 h，并用無菌的磷酸緩沖液漂洗4次后與二抗室溫反應2 h，隨后顯色、定影。用凝膠成像分析系統測定光密度，以GAPDH蛋白作為內部參照進行定量分析。

1.2.4Real-time PCR檢測相關分子表達熒光定量PCR的擴增體系為，qPCR mix（2×）：5 μl，上游和下游引物分別為1 μl，cDNA 2 μl，去離子水1 μl；擴增條件為：95℃，10 s；60℃，40 s，共擴增30個循環。采用△Ct法計算各組mRNA的表達。

1.3統計學方法

采用SPSS19.0軟件對數-據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組變量均經正態性檢驗。組內造模前后資料采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1雷帕霉素促進細胞凋亡的DAPI染色及抑制率檢測分析

DAPI染色后，雷帕霉素中、高劑量組的胃癌SGC7901細胞存在部分皺縮，細胞內可見部分凋亡小體，且細胞體積較對照組變小；而低劑量的雷帕霉素對細胞的形態基本無明顯影響（圖1）。同時，細胞計數試劑盒8檢測法分析抑制率發現，雷帕霉素低劑量、中劑量和高劑量組均可抑制細胞的增殖，差異具有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.2PI3K蛋白的表達

研究發現，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的PI3K蛋白表達明顯降低，且與對照組比較，差異具有統計學意義（P=0.012，F= 21.54）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后PI3K表達降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖1　雷帕霉素促進細胞凋亡的DAPI染色分析（bar=100 μm）

表1　雷帕霉素抑制胃癌細胞增殖分析（±s）

表1　雷帕霉素抑制胃癌細胞增殖分析（±s）

組別對照組（n=8）低劑量組（n=8）中劑量組（n=8）高劑量組（n=8）抑制率（%）6 h 0.12±0.02 7.6±1.23 14.5±3.02 23.3±4.21 12 h 0.23±0.04 10.4±2.01 19.6±3.07 29.7±5.01 24 h 0.24±0.03 14.6±2.55 21.5±3.88 39.6±4.78 48 h 0.25±0.05 22.4±3.74 39.7±6.14 52.5±6.37

圖2　四組PI3K蛋白的表達情況

2.3AKT蛋白的表達

研究發現，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的AKT蛋白表達明顯下降，且與對照組比較，差異具有統計學意義（P=0.028，F=28.37）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后AKT表達降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。（圖3）

圖3　四組AKT蛋白的表達情況

2.4mTOR蛋白的表達

研究發現，雷帕霉素處理細胞48 h后，SGC7901細胞的mTOR蛋白表達明顯下降，且與對照組比較，差異具有統計學意義（P=0.017，F=25.77）；同時，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后mTOR表達降低，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。（圖4）

圖4　四組mTOR蛋白的表達情況

2.5雷帕霉素上調PI3K/AKT通路相關蛋白的mRNA表達

Real-time PCR分析該通路相關蛋白mRNA表達發現，雷帕霉素處理細胞后PI3K、AKT及mTOR蛋白mRNA表達均明顯降低，且與對照組比較，中劑量和高劑量組差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。另外，與蛋白檢測結果一致，中劑量和高劑量組雷帕霉素處理細胞后PI3K、AKT及mTOR蛋白mRNA表達降低，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。（表2）

表2　四組PI3K/AKT通路相關蛋白mRNA的表達量（±s）

表2　四組PI3K/AKT通路相關蛋白mRNA的表達量（±s）

組別（n=8）對照組低劑量組中劑量組高劑量組PI3K 7.44±0.92 7.29±0.87 6.56±1.02 5.44±0.72 AKT 6.81±0.82 6.68±0.91 6.43±1.04 5.43±0.43 mTOR 6.35±1.02 6.14±0.99 5.88±1.33 5.12±0.69

3　討論

胃癌是臨床上最常見的消化系統惡性腫瘤，嚴重影響患者的生活質量，具有較高的病死率，給患者家庭和社會帶來了嚴重的經濟負擔。胃癌發病的早期癥狀不明顯，診斷困難，因此手術的成功切除率較低，患者的5年生存率也較低［10］；同時，胃癌手術切除后復發的比例較高。因此，化療藥物輔助術后治療在提高患者生存率和生活質量方面發揮不可替代的作用。雷帕霉素是大環內酯類的免疫抑制劑，具有阻斷T淋巴細胞及其他細胞由G1期向S期的轉化過程。本文研究發現，雷帕霉素促進了胃癌細胞SGC7901發生細胞凋亡，且具有劑量依從性；同時免疫印跡法結果顯示雷帕霉素下調了PI3K、AKT及mTOR蛋白及mRNA的表達。因此，雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發揮腫瘤抑制作用。

PI3K/AKT信號通路是多種生理及病理過程的共同通路，且參與了多種腫瘤的增殖、分化及轉移過程［11-12］。相關研究在分析PI3K/AKT/ERK通路與胃腸道腫瘤的關系時發現，PI3K/AKT通路中相關蛋白在胃腸道腫瘤組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織，且該蛋白與患者的年齡及臨床分期等無關聯，表明PI3K/AKT通路中相關蛋白在胃腸道組織中高表達，并與腫瘤發生的早期事件存在關系［13］。已有的研究證實，PI3K/AKT通路與腫瘤生理過程中的免疫調控具有密切的相關性［14］。同時，在分析PI3K/AKT通路與CA916798誘導肺癌患者對順鉑耐藥的相關性研究中也發現，CA916798是PI3K/AKT信號通路的下游靶點，肺癌患者對順鉑的耐藥性可能與轉錄水平上CA916798的調控有關［15］。有研究對胃腸道間質瘤與PI3K及AKT蛋白的相關性分析中也發現，AKT mRNA水平在高侵襲及中度侵襲腫瘤中的表達明顯高于對照組，即AKT的表達陽性率與腫瘤侵襲轉移和黏膜受侵襲密切相關，同時PI3K與AKT蛋白的表達呈現明顯的正相關性［16］。本研究證實，雷帕霉素在抑制腫瘤細胞增殖的同時，對SGC7901細胞的PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達呈現抑制作用，且具有劑量依從性，表明激活的PI3K/AKT信號通路可能參與了雷帕霉素引起的胃癌細胞增殖抑制過程。細胞凋亡是細胞的程序化死亡過程，是抗腫瘤藥物發揮作用的主要作用機制。DAPI染色是通過DAPI透過細胞膜與DNA強力結合表現熒光檢測細胞的凋亡狀態。本研究發現，DAPI染色后中、高劑量的胃癌SGC7901細胞存在部分皺縮、細胞內可見部分凋亡小體，且細胞體積較對照組變小，而低劑量雷帕霉素對細胞的形態基本無明顯影響，表明中、高劑量的雷帕霉素引起了胃癌SGC7901細胞的凋亡過程。同時，細胞計數試劑盒8檢測法分析也獲得相同的結論：雷帕霉素提高了細胞的抑制率，且其抑制細胞的增殖具有時間和濃度依賴性，也表明雷帕霉素抑制細胞的增殖過程。

因此，激活的PI3K/AKT信號通路參與了雷帕霉素引起的腫瘤細胞的生長抑制，而雷帕霉素主要通過抑制PI3K、AKT及mTOR的過表達發揮腫瘤抑制作用。在今后的抗胃癌新藥研發是可以將PI3K/AKT信號通路蛋白作為藥物研制的潛在靶點，從而探索該通路蛋白表達抑制腫瘤細胞增殖的可能性，同時，采用基因沉默方法抑制PI3K/ AKT信號通路相關蛋白過表達也可能是未來抗胃癌治療的手段。

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Role of rapamycin in the PI3K/AKT mediated apoptosis of SGC7901 cell line

SONG Shi-mao#CHEN Yu ZHANG Zhi-guo LUO Zhi-guo
Department of Oncology，Hubei Taihe Hospital，Hubei Medical University，Shiyan 442000，Hubei，China

ObjectiveTo explore the role of rapamycin in the apoptosis of SGC7901 cell line which is mediated by PI3K/AKT signaling pathway.MethodSGC7901 cell line were randomized into 4 groups as control group，and treatment groups of rapamycin with low，medium and high dose（n=8）.The apoptosis of cell line in each group was detected by DAPI staining；western blotting and real-time PCR tests were utilized in determining the expression of related proteins as PI3K，AKT，mTOR and mRNA in PI3K/AKT signaling pathway.ResultRapamycin could induce apoptosis of SGC7901 cell line in a dose dependent and time dependent manner，with statistically significant differences observed（P＜0.05）；the expression of PI3K，AKT and mTOR in SGC7901 cell line was significantly downregulated by rapamycin as demonstrated in western blotting（P＜0.05）.ConclusionRapamycin inhibits SGC7901 mainly through restraining the over expression of PI3K，AKT and mTOR.

apoptosis；PI3K/AKT signaling pathway；rapamycin；western blotting

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.31

2016-03-03）

（corresponding author），郵箱：ssm88m@163.com