五氯酚鈉膠體金快速檢測試紙條的研制

羅曉琴 ，韓 深，呂艷秋，劉 螢，曹東山，王建霞

(1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206；3.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；4.北京市昌平區動物疫病預防控制中心，北京102200)

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五氯酚鈉膠體金快速檢測試紙條的研制

羅曉琴1,2，韓 深3，呂艷秋4，劉 螢3，曹東山1,2，王建霞1,2

(1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206；3.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；4.北京市昌平區動物疫病預防控制中心，北京102200)

[目的]研制五氯酚鈉膠體金快速檢測試紙條。[方法]利用膠體金免疫層析技術，研制一種快速檢測豬肉、雞肉、魚、蝦、水質中五氯酚鈉的試紙條。[結果]經測試，該試紙條對豬肉、雞肉、魚、蝦的檢測限為1 μg/kg，對水質的檢測限為2 μg/kg，檢測時間為15 min，假陽性率和假陰性率均為0。[結論]該方法準確、可靠，使用簡便，適合大量樣品的現場檢測。

五氯酚鈉；膠體金免疫層析試紙條；快速檢測

五氯酚鈉(PentachlorophenoI-Na，簡寫PCP-Na)是五氯酚的鈉鹽，屬于有機氯農藥，可作為殺蟲劑、抗菌劑、防腐劑使用[1-3]。五氯酚鈉易在動物體內富集，能夠通過食物鏈進入人體，嚴重危害人體健康[4-5]。因此，美國環境保護署(EPA)將五氯酚鈉列為可疑致癌物質，并限制其使用[6]。我國農業部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》，禁止在水生動物養殖中使用[7]。

GB 29708—2013《食品安全國家標準 動物性食品中五氯酚鈉殘留量的測定》、HJ 591—2010《水質 五氯酚的測定 氣相色譜法》分別使用氣相色譜-質譜法、氣相色譜法測定動物性食品以及水質中的五氯酚鈉殘留量[8]。目前，國內對于五氯酚鈉的分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-電子捕獲法、氣相色譜-氫火焰法等[9-15]。該方法具有靈敏度高、結果準確等優點，但資金和人員等投入成本較高。針對五氯酚鈉檢測技術上的不足，筆者設計了一種利用膠體金免疫層析技術檢測豬肉、雞肉、魚、蝦、水質等樣本中五氯酚鈉的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低，適合于批量樣品的篩選檢測，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國豬肉、雞肉、魚、蝦、水質等樣本企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。

1　材料與方法

1.1材料與儀器五氯酚鈉、各種交叉反應藥物(純度≥95%)等標準品購自北京標準物質研究中心；氯金酸(HAuCl4·3H2O)、卵清蛋白(OVA) 均購自美國Sigma公司；檸檬酸三鈉、碳酸鉀購自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復溶液由北京勤邦生物技術有限公司提供；渦旋儀、均質器均購自湖南湘立科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1五氯酚鈉半抗原的制備。1.0 g五氯酚鈉與4溴丁酸乙酯在DMF中，在無水碳酸鉀與碘化鈉的催化下，反應生成五氯酚-4溴丁酸乙酯產物，經乙酸乙酯萃取，水洗，柱層析純化分離，得到中間產物，中間產物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應，水解生成半抗原，經乙酸乙酯提取，二氯甲烷重結晶，得到半抗原產物(圖1)。

圖1　五氯酚鈉半抗原合成Fig.1　Half antigen synthesis of pentachlorophenol-Na

取上述產物經核磁共振氫譜測定，化學位移在4.0 ppm處為鄰近酚氧的亞甲基信號峰，2.0 ppm處兩組為亞甲基信號峰，11 ppm處為羧基氫信號峰，說明半抗原合成成功。

1.2.2免疫原的制備——五氯酚鈉半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯物合成。取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中，4 ℃下攪拌30 min，得到反應液A。稱取BSA 50 mg，使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH 7.2)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質。分裝，于-20 ℃保存備用。

1.2.3包被原的制備——五氯酚鈉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯物合成。取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中，4 ℃下攪拌30 min，得到反應液A。稱取OVA 50 mg，使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH 7.2)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質。分裝，于-20 ℃保存備用。

1.2.4五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標記物的制備。在磁力攪拌下，用0.2 mol/L碳酸鉀溶液調膠體金的pH至7.2，按1 mL膠體金溶液中加入60 μg的標準向膠體金溶液中加入五氯酚鈉單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置10 min，加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在膠體金溶液中的終濃度為1%(體積百分含量)，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，置于4 ℃備用。

1.2.5五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標記物凍干。將五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標記物凍干至微孔試劑上，向微孔試劑微孔板中加入100 μL五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50 ℃下，預凍3 h后，再真空干燥15 h，即可取出，得到凍干有五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，密封保存。

1.2.6樣本前處理方法。豬肉、雞肉、魚、蝦樣本前處理：取已去脂肪的組織樣本于均質器中均質；稱取2 g勻漿好的組織樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，加入1瓶樣本提取劑，用渦旋儀渦動3 min，室溫(20～25 ℃)3 000 r/min下離心5 min；移取3 mL上層有機相至10 mL聚苯乙烯離心管中，于50～60 ℃水浴氮氣流或空氣流下吹干；加入300 mL樣本復溶液，用渦旋儀渦動20 s后待檢。水質樣本：無需前處理。

1.2.7檢測方法。用微量移液器吸取100 μL待檢樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。室溫(20～25 ℃)孵育3 min后，吸取混勻液約70 uL垂直滴于組裝好的試紙條。液體流動時開始計時，反應10 min，根據示意圖判定結果或通過膠體金分析儀讀取檢測結果(圖2)。其他時間判讀無效。

圖2　五氯酚鈉膠體金試紙條結果判定示意Fig.2　Judgement of pentachlorophenol-Na gold immunochromatography assay strip

1.2.8樣本檢測限。在空白豬肉、雞肉、魚、蝦樣本中，分別添加五氯酚鈉標準品至質量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L，在空白水質樣本中分別添加五氯酚鈉標準品至質量濃度為0、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/L，按照“1.2.7”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據試驗結果確定樣本檢測限。

1.2.9試紙條的特異性。分別配制1 000 μg/L硝基呋喃類藥物、氯霉素等藥物，用此試紙條檢測，重復3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.10準確性。農業部文件要求膠體金免疫層析法的準確性以假陽性率和假陰性率表示[9]。取空白豬肉、雞肉、魚、蝦樣品和添加五氯酚鈉質量濃度為1 μg/L的陽性豬肉、雞肉、魚、蝦樣品各50份，取空白水質樣品和添加五氯酚鈉質量濃度為1 μg/L的陽性水質樣品各50份，用試紙條進行檢測，計算假陽性率和假陰性率。

1.2.11試紙條的重復性。從3個批次中隨機抽取試紙條，對空白豬肉、雞肉、魚、蝦和添加五氯酚鈉質量濃度為1 μg/L的陽性豬肉、雞肉、魚、蝦樣品，以及空白水質和添加五氯酚鈉質量濃度為2 μg/L的陽性水質樣品進行3次重復測定，根據試驗結果判定試紙條的重復性。

1.2.12試紙條的穩定性。將足量的試紙條保存于2～8 ℃環境中，每隔30 d取出適量，分別檢測空白豬肉、雞肉、魚、蝦樣品和添加五氯酚鈉質量濃度為1 μg/L的陽性豬肉、雞肉、魚、蝦樣品各10份，以及空白水質樣品、添加五氯酚鈉質量濃度為2 μg/L的陽性水質樣品各10份，重復測定2次，根據試驗結果判定試紙條的穩定性。

2　結果與分析

2.1樣本檢測限用試紙條檢測五氯酚鈉濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L的豬肉、雞肉、魚、蝦樣品，0、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/L的水質樣品，按照“1.2.7”方法進行檢測，確定檢測限。以僅出現C線時的最低標準品質量濃度作為試紙條的檢測限。由表1可知，該試紙條檢測限為1 μg/kg。

2.2特異性該試紙條檢測1 000 μg/L硝基呋喃類藥物、氯霉素等藥物，結果均呈陰性，即與其他藥物無交叉反應，該試紙條特異性強。

2.3準確性該試紙條檢測的50份空白豬肉、雞肉、魚、蝦、水質樣品，均顯示為陰性，假陽性率低于5%；添加五氯酚鈉質量濃度為1 μg/L的50份陽性豬肉、雞肉、魚、蝦樣品以及2 μg/L的50份陽性水質樣品檢測結果均為陽性，試紙條假陰性率為0，符合要求。

表1五氯酚鈉快速檢測試紙條的檢測限

Table 1Detection limit of pentachlorophenol-Na rapid detection strip

五氯酚鈉濃度Pentachlorophenol-Naconcentrationμg/L豬肉Pork雞肉Chicken魚Fish蝦Shrimp水質Waterquality0-----0.5----1.0++++-1.5++++-2.0+++++2.5+

注：- 表示陰性，+ 表示陽性。

Note：- stands for negative,+ stands for positive.

2.4重復性和穩定性經驗證，該試紙條的批內和批間重復性良好，在2～8 ℃下能夠保存12個月；從第13個月起，試紙條出現失效、假陰性等現象。

3　討論

(1)通過查閱文獻，發現目前檢測動物組織中五氯酚鈉殘留量的方法較少，主要集中在水樣、土壤、皮革、紡織品等方面，尚未發現能夠同時檢測豬肉、雞肉、魚、蝦、水質中五氯酚鈉的膠體金試紙等的報道。該研究的五氯酚鈉膠體金試紙條操作簡便，無需設備，操作時間僅需15 min，能夠達到定性檢測水平。由于試紙條方便、快捷、成本較低，非常適用于我國基層檢測實驗室、政府部門的市場監控檢測、臨時抽檢、排查工作中廣泛推廣使用，且能夠解決基層單位因設備和經費問題而較難開展食品中殘留物檢測和監控等工作的問題，為農業質檢、衛生部、工商管理、養殖業等機構的食品安全檢測提供檢測技術及產品[16]。

(2)五氯酚鈉半抗原通過五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯等反應制備而成，由此制備的半抗原進而制備成免疫原和包被原，制備方法均不繁瑣，便于商業化生產。

(3)該研究制備的試紙條假陰性率為0，假陽性率低于5%，且在2～8 ℃下能夠保存12個月，說明該試紙條穩定性良好，適于基層實驗室使用。

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Study on Gold Immunochromatography Assay for Rapid Detection of Pentachlorophenol-Na

LUO Xiao-qin1,2,HAN Shen3,LU Yan-qiu4et al

(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206;2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection,Beijing 102206;3.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026;4.Beijing Changping District Animal Disease Prevention and Control Center,Beijing 102200)

[Objective]The aim was to study gold immunochromatography assay strip for rapid detection of pentachlorophenol-Na.[Method]By using gold immunochromatography assay,strip for rapid detection of pentachlorophenol-Na in pork,chicken,fish,shrimp and water quality was developed.[Result]The limit of detection was 1 μg/kg in pork,chicken,fish,shrimp flesh,and 2 μg/kg in water.The results could be obtained in 15 minutes.The assay gave no false positive and false negative results.[Conclusion]The method is accurate,simple,reliable and convenient to rapidly detect pentachlorophenol-Na on the spot.

Pentachlorophenol-Na;Gold immunochromatography assay strip;Rapid detection

北京市科技計劃課題“城市地下水和地表水中PPCPs微污染物新型檢測技術、降解工藝及專項設備的研發”(Z151100002115059)。

羅曉琴(1984- )，女，廣西南寧人，高級工程師，從事食品安全檢測技術研究。

2016-07-06

TS 207

A

0517-6611(2016)25-055-03