重組人睫狀神經營養因子干預家兔視神經損傷動物模型視神經蠕變特性的分析

王玲，呂雪漫，姜琦，袁毅

(吉林大學中日聯誼醫院眼科，吉林 長春 130033)

1 引 言

視神經由視網膜神經節細胞的軸突和膠質等組成, 其損傷可以發生在視神經的每個部位, 引起視功能部分或全部喪失， 視神經損傷的預防和治療是視覺科學領域研究的熱點及難點[1]。 國內外學者對視神經損傷診斷和治療進行了大量的研究[2-5]。賀致禮[6]對自發性分化的特點、外源性和內源性睫狀神經營養因子對于細胞分化結果的影響進行了研究。結果表明， 睫狀神經營養因子能夠起到部分介導神經祖細胞自發性分化的作用。并且自發性分化是在培養基中去除有絲分裂原之后發生的。 Birch等[7]以CNTF-4對 3例患者縱向性研究表明，根據自適應光學激光掃描眼底鏡提供的高分辨率圖像，與治療側眼睛相比較，假手術側眼睛的錐間距增大，錐密度降低，提示，CNTF 具有視錐細胞保護作用。

關于視神經損傷模型以藥物干預后視神經生物力學特性研究，Jiang等[8]對視神經損傷家兔模型通過以重組人睫狀神經營養因子和中藥復光顆粒治療視神經損傷家兔后，眶內段視神經單向拉伸力學性質進行了研究。得出了視神經損傷家兔模型通過以重組人睫狀神經營養因子和中藥復光顆粒干預治療后，眶內段視神經拉伸力學性能指標有一定恢復的結論。以蠕變特性指標探討重組人睫狀神經營養因子干預視神經損傷效果罕見報道。鑒于此，實驗以視神經損傷兔為動物模型，以重組人睫狀神經營養因子進行干預治療，以蠕變特性研判重組人睫狀神經營養因子干預治療視神經損傷的效果，為臨床視神經損傷治療提供蠕變特性指標。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

6月齡健康日本大耳白家兔33只, 體重2.7～2.9 kg, 均為雌性,購于長春高新醫學動物實驗中心，許可證號SCXK(吉)2003-0004。實驗前以 10%(35 mg/Kg)水合氯醛注射家兔腹腔麻醉，檢查家兔外眼及眼底無病變的納入實驗。家兔在兔籠中飼養，家兔飼養室自然光照，室內溫度23℃-25℃, 家兔飼養室內空氣流通，家兔飼養室相對濕度55%～70%,家兔食用飼料為兔顆全價粒料，家兔自由飲水、攝食。

2.2 實驗動物分組

33只日本大耳白家兔隨機分為正常對照組11只、視神經損傷動物以重組人睫狀神經營養因子干預組11只、視神經損傷動物模型組11只。

2.3 家兔視神經損傷模型制備

按文獻[9]的方法復制家兔視神經損傷模型，將家兔俯臥固定于動物手術臺上。以濃度為1 g /L的烏拉坦( 5 mg /kg)兔耳緣靜脈注射麻醉，以手術刀切開兔右側眼頂側眶上皮膚, 暴露眶壁、眶上緣切跡, 在眶上緣切跡處向視神經管方向咬除兩側部分眶壁骨板(寬6 mm，深7～8 mm ), 剪開眼球后球筋膜, 沿上直肌向球后分離, 使球后視神經暴露。視神經游離約5 mm, 離后極部約3 mm，以上海醫療器械廠W40160(3. 7 cm )反向血管夾鉗夾同一部位視神經5 s。術野用慶大霉素液沖洗兩次后，10～0號尼龍線分層縫合。術后在家兔眼結膜囊內涂紅霉素眼膏。

2.4 造模成功標準

家兔損傷傷眼直接對光反應消失，瞳孔固定、散大;以檢眼鏡觀察眼底，視網膜血管無梗塞與出血為造模成功標準，達到以上標準的家兔作為視神經損傷模型納入實驗。

2.5 以重組人睫狀神經營養因子干預視神經損傷動物方法

視神經損傷動物以重組人睫狀神經營養因子干預組家兔于手術(造模)后立即向球后一次性注射 CNTF 50 ng/ml[9]，視神經損傷動物模型組不給予治療視神經損傷的藥物。

2.6 各組家兔視神經標本取樣方法

造模30 d后, 處死重組人睫狀神經營養因子干預組、視神經損傷模型組、正常對照組家兔，在鏡下取出眶內段視神經標本各11個，置于生理鹽水槽中，在4℃環境下保存備用。

2.7 各組動物視覺電生理檢測

對視神經損傷動物模型以重組人睫狀神經營養因子干預組、視神經損傷動物模型組動物于造模30 d后分別對動物損傷眼(右眼)和正常眼(左眼)以德國羅蘭REFZ-POZE21sompace型視覺電生理儀進行閃光視覺誘發電位(F-VEP) 檢測。記錄電極放于家兔枕骨結節上1.5～2.0 cm處，參考電極置于家兔額部正中，接地電極置于家兔耳垂；將角膜接觸鏡電極放好，接地皮膚電極置于耳垂，參考皮膚電極置于眼眶顳側，。電極放好后，以全視域閃光刺激器, 白色閃光, 閃光照度2 擋, 60 lx, 時間頻率2 Hz進行刺激。分析時間250 ms, 數據經由算機進行采集。

1.若等腰三角形的一邊長為6cm，另一邊長為9cm，求此等腰三角形的周長。（6cm是腰長還是底邊長？）

2.8 光學顯微鏡觀察兔視神經縱斷面的組織結構

取各組家兔眶內視神經各一條，標本固定于10%中性福爾馬林液 24 h。常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；縱向切片，厚度為 3 μm，蠟帶裱于涂有蛋白甘油的載玻片上；溫箱烤片，切片常規脫臘；蘇木精染色3 min，自來水沖洗；1%鹽酸分化，自來水沖洗；弱氨水返藍，自來水沖洗；伊紅染色2 min；常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；以日本東京Olympus BX51光學顯微鏡分別觀察每個視神經的形態。

2.9 蠕變實驗方法

實驗設備為長春試驗機研究所集團生產的電子萬能材料試驗機，以長春市第三光學儀器廠生產的讀數顯微鏡測量各組家兔視神經試樣的長度和直徑，各組家兔視神經拉伸試樣長度為10 mm，正常對照組家兔視神經試樣直徑1.01～1.03 mm，視神經損傷模型組家兔視神經試樣直徑0.97～0.99 mm，視神經損傷以重組人睫狀神經營養因子干預組家兔視神經試樣直徑1.00～1.02 mm。按文獻[10-12]的方法分別對每個家兔視神經試樣進行預調處理。視神經拉伸實驗溫度為36.5±1.0℃，分別將3組家兔視神經試樣裝夾在試驗機夾頭內，以0.2 Mpa/s的速度對試樣施加應力，當正常對照組視神經試樣應變達到3.98%、視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組試樣應變達到3.85%、視神經損傷模型組試樣應變達到3.78%時，各組視神經試樣應力達到0.454 Mpa時，保持應力恒定，設定視神經試樣蠕變實驗時間為7 200 s。觀察視神經試樣應力與時間的變化關系。為在實驗中保持試樣的濕度，在實驗中向視神經試樣噴灑生理鹽水。

2.10 統計學分析

計量資料以mean±SD表示，用SPSS16.0 軟件包(SPSS, Chicago, IL, USA)進行數據分析，組間數據差異的比較采用單因素方差分析法和Sceffe法，P<0.05 為差異有顯著性意義。

3 結果

3.1 各組視神經電生理檢測結果

F- VEP 記錄 圖形分析標準: P1 波幅值為自N1 波谷底至P1 波峰頂, 潛伏期為自觸發時至P1峰為止, 由計算機自動記錄, 各組動物電生理檢測結果見表1。

表1 各組視神經電生理檢測實驗結果

各組視神經電生理檢測實驗結果表明，正常對照組Pl峰值大于視神經損傷模型組和視神經損傷動物模型以人睫狀神經營養因子干預組，差異顯著(P<0.05)，正常對照組pl峰潛時值小于視神經損傷模型組和視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組，差異顯著(P<0.05)。視神經損傷模型以人睫狀神經營養因子組Pl峰值大于視神經損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組組pl峰潛時值小于視神經損傷模型組，差異顯著(P<0.05)。

3.2 各組視神經的超微結構

正常對照組視神經縱斷面的組織形態(HE染色，×400)纖維呈密集的平行排列，結構排列整齊規則，染色均勻，膠質細胞大小、排列均勻見圖1(a)，視神經損傷模型組兔視神經縱斷面的病理學改變(HE染色，×400)神經纖維束結構消失，神經纖維和膠質細胞變性、壞死，偶見溶解的細胞核見圖1(b)，視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組的兔損傷視神經縱斷面的病理學改變(HE染色，×400)視神經纖維結構尚存，較少部分視神經纖維排列不規則，視神經無明顯變細，見圖1(c)。

圖1 各組視神經的超微結構照片

3.3 各組視神經試樣蠕變曲線

由各組試樣的蠕變試驗數據以計算機進行曲線擬合，蠕變曲線見圖2。

3.4 各組視神經試樣的歸一化蠕變函數曲線

對各組視神經試樣歸一化蠕變函數數據以計算機進行曲線擬合，各組視神經試樣歸一化蠕變函數曲線見圖3。

圖2 各組視神經試樣蠕變曲線

圖3 各組視神經試樣歸一化蠕變函數曲線

3.5 各組視神經試樣歸一化蠕變函數方程的建立

J(t)=a+be-t

(3)

令：

正則方程：

(4)

分別將各組視神經蠕變實驗數據代入(4)式，解出各組試樣的a、b值，將各組試樣的a、b值分別代入(3)式得出兩組試樣的歸一化蠕變函數方程如下：

正常對照組：

視神經損傷模型組：

視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組：

4 討論

各組家兔視神經電生理檢測結果表明，視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組Pl峰值大于視神經損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組pl峰潛時值小于視神經損傷模型組，差異顯著(P<0.05)，說明重組人睫狀神經營養因子對視神經損傷動物模型的視神經具有一定的療效。

各組視神經蠕變實驗結果表明，視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子干預組7 200 s應變上升量大于視神經損傷模型組(P<0.05)。各組家兔視神經蠕變實驗最初1 800 s應變上升速度快，之后應變緩慢上升，達到設定的蠕變實驗時間7 200 s時，各組家兔視神經試樣蠕變曲線基本接近于水平，各組視神經試樣蠕變曲線變化趨勢呈指數函數關系。蠕變是視神經對生理應力適應性的反應，視神經生理范圍內的蠕變特性有利于抵抗應力，視神經的生理功能要求視神經纖維的結構完整，結構完整的視神經才具有良好的蠕變特性。分析認為視神經損傷模型家兔視神經受到鉗夾傷后，使視神經結構喪失了完整性，將會使視神經全部和部分喪失抵抗應力的能力，所以，視神經損傷模型組的蠕變特性發生了改變。

本實驗結果顯示，CNTF組視神經纖維排列較紊亂，膠質細胞核增多，部分排列不規則，可見少量細胞空泡，胞核溶視神經纖維迂曲、偶見胞核碎片，但視神經無明顯變細，較模型組損傷程度輕，通過以CNTF對視神經損傷動物進行治療，對破壞的視神經組織形態有所改變，在長時間恒應力作用下的應變上升量有所提高，說明視神經損傷以重組人睫狀神經營養因子干預后蠕變特性具有一定的恢復，說明CNTF對治療動物視神經損傷具有一定的作用。

視神經的損傷發生機制與視神經的生物力學性質密切相關。我們研究了以重組人睫狀神經營養因子干預家兔視神經損傷動物模型視神經的蠕變特性。以回歸分析的方法根據已得的蠕變實驗結果以及以往的經驗建立統計模型構建了各組坐骨神的蠕變函數方程；研究了各組視神經應變與時間之間的相關關系，建立起應變與時間變量之間的函數關系。各組視神經蠕變函數方程的建立能更好的闡明視神經的蠕變特性。從而給臨床中相同發病機制而造成視神經損傷提供粘彈性力學方面的理論依據。

以往對動物視神經損傷模型藥物干預效果分析，以生物學、組織形態學觀察等居多。本研究是以蠕變指標研判重組人睫狀神經營養因子干預視神經損傷的效果，具有創新性。