人發角蛋白凝膠對L-929細胞的增殖作用研究*

陳劍斌，許少波

(廣東省醫療器械研究所/國家醫療保健器具工程技術研究中心，廣東 廣州 510500)

1 引 言

角蛋白具有良好的生物相容性、可在體外和動物體內生物降解、可促進成纖維細胞粘附和分化、具有較高的機械強度、可自組裝等優點，而且源于人發的角蛋白還具有高生物活性、低免疫排異性、來源幾乎不受限制等特點，尤其適合應用于再生醫學的研究[1]。對人發角蛋白的研究，包括作為神經植入材料、皮膚敷料、涂層材料、人工肌腱、止血材料、支架基材等方面的研究證明，人發角蛋白對包括人角膜上皮、肺上皮、真皮成纖維細胞、成骨及成軟骨細胞、神經細胞、骨髓干細胞等都具有明顯的增殖促進作用，可以加速多種組織再生[2-3]。使用角蛋白用于軟組織填充的研究報道較少，多直接使用人發顆粒進行[4]。為此，我們提取了人發角蛋白，制備成可注射的角蛋白凝膠，并進行了動物皮下植入的實驗[5]。本研究評價了該凝膠的吸水性能及對L-929細胞的增殖作用，進一步探討該材料作為軟組織填充材料應用前景。

2 材料和方法

2.1 角蛋白溶解

從理發店收集的人發，經除雜后，使用堿性洗滌劑進行浸泡清洗3次、在50℃下烘干、烘干后的頭發按照頭發∶三氯甲烷100∶300的比例，在70攝氏度下回流2 h進行脫脂。按照雙氧水和氨水1∶3的比例混合后，將頭發浸入進行脫色，清洗烘干后剪成1～2 cm的長度備用。

脫色后的頭發，按照頭發4%，脲45%，SDS2%，巰基乙醇3%的比例在55℃下提取12 h。將反應液在2 500 g下離心(JW1024，安徽嘉文儀器裝備有限公司)20 min后，取上層清液置于MWCO 8000-14000Da透析袋(Solarbio)中，按照1∶200的比例采用去離子水透析48 h，期間去離子水每6 h更換一次。透析液置于透析袋中，埋置于聚乙烯醇粉末中進行濃縮，濃縮后稀釋成20%的角蛋白溶液在4℃下冷藏備用。

2.2 角蛋白可注射凝膠的制備

20%的角蛋白溶液，經室溫開放放置24 h后，可形成角蛋白膜，該膜經研磨過200目篩，取適量粉末裝入注射器備用。注射器在使用前，連接過濾孔徑為2 um的一次性過濾膜，吸入75%乙醇進行滅菌，反復吸入生理鹽水清洗后，排除多余的生理鹽水。注射器內粉末呈凝膠狀態的微粒，易于直接注射植入。

2.3 SDS-PAGE

采用MiniProtein II 垂直電泳系統(MiniProtein II， BIO-RAD公司)對角蛋白進行分離標記。20%的角蛋白溶液先用純水稀釋至1 mg/ml，然后取100 ul與等量SDS緩沖液混合，煮沸5 min使角蛋白變性，隨后放置于冰上。取20 ul冷卻的的變性溶液加入預先配置好的5～12%的梯度tris-HCL凝膠中，恒壓80 v 30 min后，再調至120 v 100 min。電泳分離后，用純化水沖洗凝膠5 min，重復兩次，然后用考馬斯亮藍R-250染色。將樣品與標準蛋白比較。

2.4 傅立葉變換紅外光譜

其中：當頂底板投影面積相對差<40%時，V=(S1+S2)×H/2；當頂底板投影面積相對差>40%時，

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2.5 吸水性能

由于注射器中的角蛋白粉末測試吸水率有一定的難度，實驗測試角蛋白膜的吸水率反映可注射凝膠的吸水率，如圖3(A)是制備的角蛋白膜經過干燥后的吸水率變化曲線，其最大吸水率只能達到320%左右，而未干燥的角蛋白膜B，其含水率為142%左右，對純水的吸水率可以達到850%左右。A1和A2是A在吸水后重復測試的吸水率變化曲線，B1和B2則是B在吸水后重復測試的吸水率變化曲線，可以看出他們整體上與A的吸水率變化和最大吸水率較為接近。

實驗在Shindai 法[6]基礎上，經過一定的修改，同樣采用巰基乙醇還原人發角蛋白的方法，為避免角蛋白的降解，實驗溫度控制在55℃，還原12 h，提取率相比Shindai 法的61%～65%稍有降低，接近58%，基本保持了人發角蛋白的三種組分：構成頭發中間絲的α-角蛋白(50～65 KD)以及填充中間絲之間的基質蛋白(30KD)[7]。

上述2組吸水后的材料重復2次進行干燥、吸水，測試材料吸水率的變化。

S%=(Swet-S)/ Sx 100%,其中S為膜干燥后的重量,對于組1，S=S1；對于組2，S=S2×W%。

2.6 細胞增殖性能

Mtt比色法可用來定量測量體外細胞的增殖，活力和材料的細胞毒性。小鼠成纖維細胞系l-929(南方醫科大學)復蘇后置入含血清(杭州四季青生物工程有限公司)的DMEM(美國GIBCOBRL公司)培養瓶培養，凝膠的提取按照標準iso 10993-5的方法，提取液選用純DMEM培養基，2 g凝膠使用20 ml提取液浸提24 h。陰性對照為純DMEM培養基，陽性對照為5%二甲基亞砜DMSO溶液。以浸提液和2%體積比的血清為培養介質，每樣品各5個復孔，繼續培養24、48、72 h后于光學顯微鏡下觀察拍照。各觀察期，在細胞拍照后，每孔加入20 ulMTT液，繼續培養3 h，小心吸去液體，加入二甲基亞砜DMSO 150 ul/孔，避光振蕩10 min，在酶標儀上以570 nm波長測其OD570值。相對細胞增殖率(RCV%)可以從下面公式計算。

從圖2中可以看出，人發角蛋白與角蛋白膜的紅外光譜均有明顯的酰胺Ⅰ帶(分別在1656cm-1及1650cm-1處，代表C=O的伸縮振動峰)、酰胺Ⅱ帶(分別在1541cm-1及1543cm-1處，代表N-H的變角振動峰)、酰胺Ⅲ帶(分別在1215cm-1及1233cm-1處，代表C-N的伸縮振動峰)，表現為典型的蛋白質物質[8]。此外，角蛋白中625 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅳ帶O=C-N的變形振動峰，角蛋白膜中687 cm-1處的吸收峰是酰胺Ⅴ帶N-H的變形振動峰。

RCV%=(ODTEST/ODCONTROL)×100%

將角蛋白溶液放置表面皿中，-40℃冷凍后凍干(SCIENTZ-10N,寧波新芝)，與人發、角蛋白膜分別研磨后，分別與溴化鉀混合壓片，在400 到 4000 cm-1之間測試紅外(布魯克BRUKER TENSOR 27)

3 結果與討論

3.1 SDS-PAGE分析

圖1為提取的角蛋白SDS-PAGE圖，中間2條為樣品角蛋白溶液的條帶，左右兩側為標準蛋白，通過對照，提取的人發角蛋白的三條普帶，分別對應于標準蛋白的30、50和 65 KD三部分，其中65 KD的角蛋白分布較窄，其余兩個組分的條帶相對較寬，而50 KD位置的顏色相對較深。

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圖1 人發角蛋白SDS-PAGE圖

3.2 紅外

隨著生活水平的不斷提高，人們越來越講究均衡營養，一些高脂肪食物已在市場銷售中遭遇冷淡，而一些“素”、“粗”、“雜”的蔬菜、野果與五谷卻日益受到青睞，野菜、野果、人造植物肉、蔬菜制品、高梁、玉米、大豆等已成為人們飲食中必不可缺少的食物。吃粗防病、吃雜亦補，吃素益壽的觀念正在流行起來。

對比人發的紅外譜圖發現，酰胺Ⅱ帶特征峰和酰胺Ⅲ帶特征峰的位置變化不大，說明這兩處的分子基團及其振動種類未發生變化。而人發紅外譜圖中2876 cm-1和2962 cm-1處的紅外吸收峰在角蛋白中則變化為2962 cm-1和2924 cm-1處，發生該變化的主要原因是因為人發角蛋白提取過程中，頭發中的二硫鍵(-CH2-S-S-CH2-)發生斷裂，C-H中C的電子云密度降低，使C-H的伸縮振動譜帶向低波數移動。另外，角蛋白中985 cm-1處的吸收峰代表了胱氨酸殘基C-S的特征吸收峰，1043 cm-1處的吸收峰為S=O的對稱伸縮振動峰，這兩處吸收峰在人發紅外譜圖中均未出現，說明了人發中的一部分二硫鍵基團轉化成了磺酸根[9]。由此可見，實驗從頭發中提取的人發角蛋白溶液，仍具有多肽特征。

圖2 人發和人發角蛋白的紅外譜圖

3.3 吸水性能

實驗對角蛋白膜進行吸水性能的測試，用于間接反映角蛋白水凝膠的水合性能。將直接制備的角蛋白膜分成2組，組1在40℃真空下烘干，計算含水率W%， 組2 則不經烘干處理，兩組均在稱重(S1,S2)后室溫下浸入純水中，在不同時間后取出，去除多余的水分后再次稱重(Swet)。吸水率S%的計算按照以下公式:

實驗結果可以為控制人發角蛋白凝膠的吸水率提供依據，制備的膜或粉末在未完全干燥的狀態下，會保持較高的吸水率或膨脹率。若控制干燥程度，勢必影響凝膠的吸水率，從而為凝膠的應用提供依據。實驗也發現，相對于A在20～30 min接近最大吸水率，B膜只需要10 min即可接近最大吸水率，說明完全干燥的角蛋白材料，吸水溶脹的速率要小于完全干燥的材料。相對于報道的角蛋白海綿吸水率(367%～554%)[10]，不干燥角蛋白膜有著更高的吸水率，而且所有膜的吸水速率均大于海綿，海綿材料需要20 h以上的時間能達到溶脹平衡。

圖3 角蛋白膜的吸水過程

3.4 細胞增殖

小鼠成纖維細胞系L-929在對照溶液、角蛋白提取液以及陽性對照中的細胞生長情況見圖4，總體來看細胞在對照溶液、角蛋白提取液中的數量逐步增加，且細胞形態正常，少量的死亡細胞呈現圓形且亮度明顯，符合細胞的正常代謝。而陽性對照組細胞幾乎全部死亡，呈現出規則圓形和少量細胞碎片。利用測試的OD570值經過計算，角蛋白浸提液的RCV%在三個測試期的平均增值率分別達到119%、122%和123%。

FeOx摻雜對CeO2納米晶催化甲烷選擇氯氧化反應性能的影響 …………………何潔麗，嚴 亞，楊 蓉，李婧煒（48）

圖4 不同實驗階段L-929細胞形貌

人發角蛋白的細胞相容性和對細胞的增殖已經被很多研究證實，Francesca T等[11]分別制備了人發角蛋白的涂層和水凝膠，采用L929小鼠成纖維細胞對該角蛋白水凝膠(涂層)和膠原I型水凝膠(涂層)進行對比實驗，角蛋白比膠原成倍的提高了細胞的粘附、增殖和細胞的生存能力。Stephan[12]通過對12種細胞進行培養發現，受角蛋白膜材料作用的細胞中，有9種表現出優異的增殖現象。

作為動物植入實驗的前提，我們對自行制備的角蛋白凝膠的細胞毒性進行了驗證。實驗結果表明，僅僅72 h的培養，人發角蛋白已表現出明顯的促進細胞增殖作用。考慮到該實驗是在37℃下對角蛋白凝膠只進行了24 h的浸提，由于角蛋白的交聯作用，浸提液在受凝膠作用較弱的狀態下，可達到對L929 10%左右的促進增殖作用，可以預見該材料與細胞的長期作用將會更加明顯。

4 結論

實驗采用一種新的方式，制備的人發角蛋白可注射凝膠，具有較高吸水率，良好的細胞相容性，并可促進細胞增殖。由于未使用其他交聯劑，該材料可在體內快速降解。作為一種同種異體材料，人發角蛋白凝膠有望在皮膚創傷及其他軟組織缺陷修復方面獲得進一步研究和應用。