載納米銀海藻酸鈣敷料的制備及體外細(xì)胞毒性、抗菌性能的檢測*

林志群，趙大川，郎敏，柳學(xué)文，陳瀛，陳飛，黃宗海

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普通外科，廣州 510280)

1 引 言

海藻酸鹽屬于海洋生物資源，是一種無水D-甘露糖醛酸聚合物，其來源廣泛、生物可降解、良好生物相容性使之有潛力成為優(yōu)良的生物材料[1]。以海藻酸鹽為原料研發(fā)的海藻酸鈣纖維具有高吸收性、高透氧性、良好的生物相容性、止血性能及可降解吸收性等[2-3]，這些特性使得海藻酸鈣纖維非常適合開發(fā)用于醫(yī)用敷料。

銀作為抗菌劑使用由來已久，銀離子、可溶性銀化合物、表面積大的膠態(tài)銀、納米銀等均具有殺滅細(xì)菌、真菌和霉菌的特性[4-6]。其中納米銀是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型抗菌產(chǎn)品，其依靠著量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和具有極大的比表面積[7]，因而具有傳統(tǒng)無機(jī)抗菌劑無法比擬的抗菌效果。此外，納米銀粒子具有很強的滲透性，能滲透到皮下組織，與切口接觸后迅速持久地釋放納米銀，快速有效地殺滅切口及縫線上的病原體。如今，以納米銀為基礎(chǔ)的抗菌產(chǎn)品在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。

因此，本研究結(jié)合海藻酸鹽纖維及納米銀的特性，開發(fā)一種具有高吸收性可降解醫(yī)用抗菌敷料。第一步在海藻酸鹽溶液中加入羧甲基纖維素，并用濕法紡絲得到改性后的海藻酸鈣羧甲基纖維復(fù)合物，最后利用浸漬富集法制備載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料。通過紫外-可見光分光光度計和掃描電子顯微鏡檢測敷料的物理學(xué)表征，再結(jié)合細(xì)胞毒性及抗菌性能檢測，篩選出合適濃度的載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料。

2 實驗

2.1 實驗試劑儀器

海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉購自愛爾蘭貝朗公司，納米銀購自張家港耐爾納米科技公司，LO2人正常肝細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科提供，實驗菌株由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院微生物研究所提供。紫外-可見光分光光度計：美國Thermo NanoDrop 2000，掃描電子顯微鏡：日本Jeol。

2.2 載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料的制備

將海藻酸鈉、羧甲基纖維素納按8.5:1.5比例溶于水中，高速攪拌，形成粘稠溶液，脫泡過濾后通過噴絲孔擠出到含有鈣離子的凝固浴中,形成固態(tài)海藻酸鈣羧甲基纖維長絲。該長絲經(jīng)過拉伸、水洗、脫水干燥、卷曲形成纖維，纖維可梳理成網(wǎng)，制成海藻酸鈣羧甲基纖維復(fù)合物，再利用浸漬富集法，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5、1、2、4%的載納米銀海藻酸鈣羧甲基纖維素復(fù)合物，簡稱：載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料(slver nanoparticles-calcium alginate，AgNPs-Ca)。

2.3 敷料物理學(xué)表征檢測

敷料在紫外和可見光的吸收特性由紫外-可見光分光光度計測定，檢測波長范圍200～800 nm；利用掃描電子顯微鏡觀察載納米銀海藻酸鈣敷料中纖維及納米銀的形態(tài)、分布情況。

2.4 細(xì)胞毒性檢測

將100 μl濃度為6 X 104/mL的人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后棄原液，將普通敷料、海藻酸鈣敷料、0.5% AgNPs-Ca、1% AgNPs-Ca、2% AgNPs-Ca、4% AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7個組的樣品浸提液各100 μl，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。采用CCK-8法測定LO2細(xì)胞培養(yǎng)的相對增殖率(RGR)，評價材料的細(xì)胞毒性。

2.5 抗菌性能檢測

2.5.1抑菌圈法 采用臨床常見四種菌株，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌作為實驗用菌，將菌液均勻涂板后，并將制備四種濃度載納米銀海藻酸鈣敷料剪成直徑10 mm的圓片貼附于培養(yǎng)板上，放置于細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后計算抑菌圈大小。

2.5.2振蕩抑菌法 將上述菌種配制成濃度3X104cfu/ml的菌液， 普通敷料、海藻酸鈣敷料、0.5% AgNPs-Ca、1% AgNPs-Ca、2% AgNPs-Ca、4% AgNPs-Ca、Ag+-Ca等7個組的樣品放置于菌液內(nèi)振蕩培養(yǎng)，分別于振蕩前、振蕩后1、2 h取菌液涂板，培養(yǎng)24 h后計數(shù)，并計算抑菌率。

抑菌率=(初始細(xì)菌濃度-第n小時細(xì)菌濃度)/初始細(xì)菌濃度×100%

3 結(jié)果與討論

3.1 物理學(xué)表征檢測

圖1為載納米銀海藻酸鈣敷料的紫外可見光吸收光譜，藍(lán)色曲線代表載納米銀海藻酸鈣敷料，紅色曲線代表海藻酸鈣敷料，從中可以看出，載納米銀海藻酸鈣敷料水溶液的吸收峰位于416 nm處，此外其分布范圍在350～550 nm之間。而未添加納米銀的海藻酸鈣敷料的紫外光譜則沒有特殊的吸收峰。納米銀Ag0的特征吸收峰位于400 nm附近，而按照粒徑的不同，存在一定的藍(lán)移或紅移現(xiàn)象[8]。此吸收峰即為納米銀的吸收峰，說明載納米銀海藻酸鈣敷料確實存在納米銀，而且在去離子水中能自由釋放出納米銀，另外，其分布范圍說明了海藻酸鈣中納米銀具有較低的分散性。

圖1 載納米銀海藻酸鈣敷料的紫外-可見光吸收光譜

圖2a為50倍電子顯微鏡下的載納米銀海藻酸鈣敷料，可以看出，敷料纖維致密，相互交織，纖維粗細(xì)大致相等。圖2b為5000倍掃描電子顯微鏡下的載納米銀海藻酸鈣敷料，敷料中納米銀呈規(guī)則的球形，粒徑在80～100 nm之間，附著于海藻酸鈣纖維表面及空隙之間。

圖2 載納米銀海藻酸鈣敷料的掃描電子顯微鏡照片

Fig2SEMphotographsofAgNPs-Cadressing

3.2 細(xì)胞毒性檢測

培養(yǎng)24 h后， 普通敷料、海藻酸鈣敷料組的細(xì)胞，貼壁生長好，細(xì)胞密度大，細(xì)胞呈長梭形，折光性強，細(xì)胞突充分伸展，可見核分裂細(xì)胞。0.5% AgNPs-Ca、1% AgNPs-Ca實驗組貼壁生長好，細(xì)胞密度較大，大多數(shù)細(xì)胞成長梭形，可見少量細(xì)胞圓縮，細(xì)胞連接成單層，分裂相多見，兩者未見明顯區(qū)別。2% AgNPs-Ca實驗組貼壁生長較差，細(xì)胞密度下降，少數(shù)成梭形細(xì)胞，可見明顯的細(xì)胞圓縮，細(xì)胞狀態(tài)較差。4% AgNPs-Ca、Ag+-Ca實驗組細(xì)胞存在大量圓縮現(xiàn)象，細(xì)胞密度顯著下降，核固縮，死亡細(xì)胞明顯增多，少數(shù)貼壁細(xì)胞聚集成團(tuán)。

CCK-8檢測細(xì)胞增值率表明，海藻酸鈣毒性分級為0級，0.5% AgNPs-Ca、1% AgNPs-Ca敷料為I級，無細(xì)胞毒性，2% AgNPs-Ca開始表現(xiàn)出輕度的細(xì)胞毒性，到了4% AgNPs-Ca和Ag+-Ca組，細(xì)胞毒性繼續(xù)加大。從圖3、表1中可以看出，敷料的細(xì)胞毒性與添加的納米銀呈濃度依賴性。當(dāng)納米銀添加量少于1%時，載納米銀抗菌敷料表現(xiàn)出良好的生物相容性。而含銀離子的成品敷料，在此次細(xì)胞增殖實驗中，表現(xiàn)出中度的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性為IV級。

注：與普通敷料組比較，*表示P<0.05,***表示P<0.001

表1 各組敷料作用于LO2細(xì)胞的細(xì)胞相對增殖率及毒性評價

載納米銀海藻酸鈣敷料的細(xì)胞毒性與納米銀呈濃度依賴性，并且與納米銀顆粒的直徑成反比關(guān)系。暗視野鏡檢顯示納米銀粒徑越小，進(jìn)入細(xì)胞的量越多[9]。原因在于納米銀粒徑越小，相對表面積越大，分解釋放的Ag+越多，細(xì)胞毒性越明顯。不過也有研究認(rèn)為納米銀粒徑越小，越容易穿透細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，可能只是一個單純的物理效應(yīng)[10]。此外，納米銀顆粒的細(xì)胞毒性還同時具有時間依賴性，這意味著同種濃度下，細(xì)胞與納米銀粒子接觸時間越長，細(xì)胞毒性越明顯，但是作為創(chuàng)面敷料，并不需要長期放置于體內(nèi)，時間依賴性在敷料的應(yīng)用影響不大。

0.5% AgNPs-Ca、1% AgNPs-Ca不影響人肝細(xì)胞LO2的增殖活性,細(xì)胞毒性為I級，均無細(xì)胞毒性，說明這兩種含銀量的海藻酸鈣敷料具有良好的生物相容性，符合生物醫(yī)用材料的基本要求。

3.3 抗菌性能檢測

3.3.1抑菌圈法 抑菌圈提示未添加納米銀的海藻酸鈣敷料在四個菌株中均未見明顯抑菌圈，而添加了不同濃度納米銀的四組海藻酸鈣敷料其抑菌圈大小呈濃度依賴性。在對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌四個菌株的抑菌圈中，0.5% AgNPs-Ca所產(chǎn)生的抑菌圈大小介于11.8～13.6 mm，1% AgNPs-Ca所產(chǎn)生的抑菌圈大小介于13.0～14.7 mm，2% AgNPs-Ca所產(chǎn)生的抑菌圈大小介于13.5～16.2 mm，4% AgNPs-Ca所產(chǎn)生的抑菌圈大小介于15.3～18.0 mm。抑菌圈檢測法反映了敷料與微生物直接接觸后的抑制性能，海藻酸鈣作為敷料載體，本身并不具有抗菌性能，真正發(fā)揮抗菌作用的是吸附在纖維上的納米銀，其抗菌能力隨納米銀濃度升高而增加。

圖4 五組敷料對金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(E.Coli)、銅綠假單胞菌(PSA)、白色念球菌(CA)的抑菌圈柱形圖比較(Mean±SD)

3.3.2振蕩抑菌法 圖5可以看出載納米銀海藻酸鈣敷料對四個菌株的抗菌特性具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性。1 h時，低濃度的載納米銀海藻酸鈣敷料對實驗菌的抑制效果一般，但2 h時，幾乎所有載納米銀海藻酸鈣敷料對四個菌株的抑菌率均超過90%。4個濃度分組的AgNPs-Ca對于四個菌株都具有不錯的抗菌性，且其抗菌性具有時間依賴性及濃度依賴性。4% AgNPs-Ca可抑制所有菌株的生長，在2 h內(nèi)，抑菌率均超過98%，特別是對金黃色葡萄球菌與白色念球菌，1小時內(nèi)即可將細(xì)菌完全抑制至無法檢測出。1% AgNPs-Ca對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念球菌的2 h抑制率超過97%。Ag+-Ca對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用類似于AgNPs-Ca 敷料，但是對金黃色葡萄球菌、白色念球菌的抑菌性明顯不及AgNPs-Ca 敷料。單純海藻酸鈣敷料對金葡菌、白色念球菌和銅綠假單胞菌的在1h時表現(xiàn)出輕度的抑菌性能，而到了2 h抑菌率為0%。

注：“NA”表示經(jīng)計算后抑菌率小于0，視為無抑菌性能

經(jīng)改性后的海藻酸鈣羧甲基纖維復(fù)合物具有高吸收性，表面具有大量負(fù)電基團(tuán)(-OH，-COOH等)，可將納米銀吸附并結(jié)合于纖維表面，基于此制備成的載納米銀海藻酸鈣敷料除了保持原纖維的高吸收性、可降解性外，在濕潤環(huán)境中還能緩慢釋放出納米銀粒子。納米銀顆粒呈超細(xì)狀態(tài)，表面積極大，在溶液里能電離釋出Ag+，Ag0→Ag++e-，所以，納米銀的抗菌活性與Ag+有關(guān)，后者可與菌體中酶蛋白的-SH迅速結(jié)合，使得以此為必要基團(tuán)的酶失去活性，從而達(dá)到殺滅病菌，修復(fù)傷口的作用[11]。但研究發(fā)現(xiàn)納米銀的抗菌性能不單單依靠電離出Ag+，還因為納米銀的顆粒具有獨特的小尺寸效應(yīng)，加上有效濃度為納摩爾級別的，而Ag+是微摩爾級的，可使納米銀輕松穿透菌體細(xì)胞膜，待細(xì)胞膜破損后Ag+便可自由進(jìn)入[12-13]。最近也有報道認(rèn)為決定納米銀抗菌活性的不是顆粒的晶體和物理學(xué)大小，而在于其流體尺寸[14]。在決定納米銀的穿膜效應(yīng)中，顆粒的形狀也是一個重要的因素，其中球形和六面體納米銀最容易穿透細(xì)菌細(xì)胞膜[15]。

本實驗選擇的菌株代表了臨床常見的革蘭陽性、陰性菌及真菌，這些菌株都被載納米銀海藻酸鈣敷料明顯抑制，其中，相比Ag+-Ca敷料，AgNPs-Ca對革蘭陽性菌和真菌的抑制性能更好，這可能與AgNPs強大的穿透能力有關(guān)。海藻酸鈣纖維1 h時表現(xiàn)出一定抑菌性能，這可能是海藻酸鈣吸附了部分菌量，導(dǎo)致整體菌液濃度下降。對于海藻酸鈣-納米銀復(fù)合材料來說，海藻酸鈣具有的膨脹效應(yīng)及吸附能力[16]，使得微生物與納米銀粒子充分接觸，可提供一種協(xié)同殺菌效應(yīng)。

4 結(jié)論

本實驗制備的載納米銀海藻酸鈣抗菌敷料經(jīng)表征檢測證實纖維粗細(xì)大致相等，納米銀吸附均勻、粒徑均一，分散性低。載銀量1%的海藻酸鈣敷料無明顯細(xì)胞毒性，同時具有良好的抗菌性能，對臨床四種常見菌株均有明顯的抑制作用，是一個理想的載銀濃度。