一種新型顯色生物芯片識讀儀軟件的設計*

陸恩澤，林志松，朱濱△，邢軍芬

(1.上海應用技術學院 電氣與電子工程學院，上海 201418；2.上海百傲科技股份有限公司 上海 201418)

1 引 言

生物芯片技術是近些年產生的一項生物高新技術，它以載玻片，塑料片或者硅片為介質，上面固定了大量按特定方式和手段排列的核酸片段作為探針，探針代表了特定的基因信息[1-2]。其主要用于疾病的檢測預防，用藥指導，食品安全檢測等領域[3]。目前市場上的生物芯片根據探針標記方法可分為兩大類：熒光標記生物芯片和顯色標記生物芯片，由于顯色標記芯片的原料易得、制作成本低，并且顯色芯片檢測設備價格低廉、穩定性好，顯色生物芯片逐漸成為市場主流。生物芯片與生物靶標進行反應后，可以獲得人體內生物靶標的各種信息并以圖像呈現，生物芯片識讀儀對圖像進行采集、分析、處理，并輸出人體內生物靶標的各種信息。

目前同類型顯色生物芯片識圖像讀儀配套軟件存在一些缺陷，比如上海百傲科技生產的第二代生物芯片識讀儀是將掃描得到的圖片通過USB數據線傳輸到PC端，再使用Visual C++編寫的圖像處理程序對圖片進行分析，然而單獨使用Visual C++編寫圖像處理程序，代碼較為復雜。而且對于微陣列圖像信號點的識別和定位，還需以人工手動操作的方式進行。這無疑降低了工作效率，一定程度上制約了顯色生物芯片產品的發展。而且現有的顯色生物芯片識讀儀軟件，缺乏對于原始數據的記錄保存。鑒于此，我們開發了一套新型顯色生物芯片識讀儀配套軟件。本軟件在Linux嵌入式系統下使用，配置了opencv的eclipse編寫圖像處理程序。opencv是開源發型的計算機視覺庫，支持Windows和Linux操作系統，具有優化代碼，統一結構和強大的圖像和矩陣運算能力，減少圖像處理算法難度[4]。

2 生物芯片識讀儀系統簡介

前期已自主研制了基于CCD的顯色生物芯片識讀儀，在此基礎上設計本研究所報道的識讀配套軟件，配套軟件由分析軟件和判型軟件構成。芯片識讀儀通過CCD工業相機拍攝生物芯片生成原始圖像，圖像以BMP格式存儲。每張芯片貼有CODE128條形碼，條形碼代表芯片圖像的陣列信息，識讀儀掃描條碼信息傳遞給分析軟件，分析軟件對圖像進行處理分析。本圖像分析軟件是在CCD相機中運行的，直接在識讀儀內部對生物芯片圖像進行處理分析，最終輸出相關基因信號點的強度值。識讀儀與PC端通過有線以太網連接進行數據傳遞。分析數據傳遞到PC端，根據生物芯片產品的類型以及獲得的信號值進行基因判型。軟件的硬件拓撲結構見圖1。

圖1 軟件硬件拓撲結構圖

3 識讀儀圖像分析軟件架構設計

圖像分析軟件主要是實現基因信號點的精準讀值[5]。從軟件功能上來講，本研究設計的圖像分析軟件思路是對原始圖像進行預處理，從而完成信號點識別和坐標信息提取，最終根據坐標信息讀取原始圖像信號點真實值。軟件還應具備信息存儲功能，以及實現軟件與PC端的通信。見圖2。

圖2 圖像分析軟件架構

4 生物芯片圖像處理與分析：

4.1 圖像預處理

圖像預處理是為了實現信號點準確定位。生物芯片是通過高精度的點樣儀制備的，因此，信號點的區域位置和機械尺寸是固定的。本軟件先對原始圖像(圖3)裁剪取出成像ROI區域，ROI區域的提取減少了圖像處理工作量。接著使用亮度歸一化方法增強信號點與背景的對比度，有效提高了輪廓識別效果。亮度進行歸一化采用直方圖均衡法，本研究使用了opencv中的cvEqualizeHist函數用于此操作。接著對歸一化后的圖像進行反色二值化，由于生物芯片圖像的每個信號點強度值不一，且受背景光源的影響導致背景不均勻，在此采用局部自適應閾值法對反色后的圖像進行二值化，閾值由局部鄰域塊高斯加權得出。根據本生物芯片圖像信號點大小，通過反復實驗，設定局部鄰域塊大小為15。

圖3 顯色生物芯片圖像

生物芯片圖像的噪聲主要來源于芯片制備過程中灰塵的污染，雜交的實驗污染，待檢測樣品中核酸，蛋白質，細胞或組織碎片的干擾，以及識讀儀使用過程中的污染[6]。圖像的噪聲影響信號點的識別和定位，因此圖像去噪至關重要。根據顯色生物芯片圖像噪聲特點，本軟件使用數學形態學運算[7]對圖像進行去噪，運算方法為開運算，內核的形狀為圓形。圖4為對圖3預處理后的效果圖。

圖4 預處理后二值化圖像

4.2 信號點識別

本研究在圖像預處理中使用亮度歸一化，增強了前后景對比度，因此，信號點識別中主要使用輪廓搜索的方法。使用Canny邊緣檢測算法進行邊緣檢測，同時使用opencv提供的cvFindContours()函數搜尋信號點輪廓。形態學去噪并不能完全消除噪聲的影響，圖4中依然會存在噪點。軟件在輪廓搜索時勢必會取到灰塵輪廓，導致對信號點的坐標定位錯誤。通過大量生物芯片圖像分析可見，灰塵輪廓遠小于信號點輪廓，且噪點所處的位置不在陣列位置上(見圖4)。本軟件搭建了配置文件處理模塊，文件中設置了信號點識別與信號點取值所需的配置參數。軟件對所有輪廓進行搜索排序，篩選出輪廓大小符合設定閾值的信號點。對于每個輪廓中心位置，使用opencv中的cvBoundingRect()計算出該輪廓的外接矩形記為rect，該矩形的位置和長寬分別為rect.x，rect.y，rect.width和rect.height，則輪廓中心坐標公式為(rect.x+rect.width/2, rect.y-rect.height/2)。

4.3 信號點定位

本軟件運行的識讀儀在掃描過程中自動讀取芯片條碼信息，其代表芯片圖像的陣列信息。本軟件根據條碼信息實現信號點自動定位代替人工輸入陣列信息的步驟，有效避免自動定位的錯誤。見圖3，本軟件處理的所有生物芯片圖像均存在最左邊3列標志列，而其他列探針區域信號點不一定顯色,而熒光生物芯片探針區域均有強度值不一的熒光點。在本設計中，軟件先確定三列質控點位置，再定位其他信號點。若采用文獻[8]所示的基于圖像投影定位方法，當存在大面積未消除背景噪聲時會定位失敗。而本軟件算法會對找到的每個點輪廓遍歷搜索鄰居點，根據點的坐標值判斷是否為某種間距的點陣，再找點陣中的最左列和最上行，最后確定標志列區域位置，再根據配置文件預設行列間距生成虛擬定位網格。對其他確定位置點陣各列各行點的分別計算橫縱坐標值和虛擬定位網格線坐標值的差值，按誤差最小來擬合某行和某列的垂直線和水平直線，實現對虛擬網格線坐標的修正。按照此算法實現的信號點識別和定位效果見圖5。

圖5 信號點識別和定位結果

4.4 信號點取值

本軟件對信號點區域透光率值從大到小排序，根據配置文件設定的正常透光率范圍閾值參數，剔除超過正常透光范圍的像素點，計算其余像素點透光率的平均值，作為該信號點區域的透光率，從而能排除灰塵噪點干擾準確取值。在選取背景值上，軟件對框定背景范圍內所有像素點的透光率值，將其從小到大排序，取透光率最大的5%的像素點平均值做為全局背景值。再使用同樣方法對每個信號點所在大小為15像素局部塊區域計算得出局部背景值。比較局部背景值與全局背景值的差異，當受到噪聲影響差值大于閾值時，選擇全局背景值進行計算。實際輸出信號值計算公式如下：

式中v代表輸出信號值，f為前景信號值，bj為局部背景值，bq為全局背景值，th為本軟件設定的差值閾值。

4.5 數據輸出模塊

數據輸出模塊將所有的信號點位置和取值信息輸出到Linux系統下搭建的samba服務器的共享文件夾中，同時輸出原始圖像，格式為BMP。PC端軟件根據識讀儀的IP地址通過網上鄰居獲取相關數據文件。

4.6 配置文件模塊

配置文件使用LUA腳本，其中定義了信號點定位與取值所需的相關配置參數,本軟件在進行一系列圖像處理分析過程中均會調用此配置文件。Lua腳本可以很容易的被C/C++ 代碼調用，也可以反過來調用C/C++的函數，這使得Lua在應用程序中可以被廣泛應用。不僅作為擴展腳本，也可以作為普通的配置文件，代替XML,ini等文件格式，并且更容易理解和維護。

5 基因判型軟件

設備讀取的信號值最終傳送到PC端基因判型軟件，基因判型軟件根據芯片的類型，將信號值填入相應內嵌公式的excel模板表格，自動計算各探針點信號比值，通過與實驗統計確定的純合/雜合基因判定閾值[9]進行比較分析，判定所檢測各基因類型并自動以表格形式輸出結果。

6 顯色生物芯片識讀儀圖像分析軟件的開發工具

本圖像軟件使用ANSI C語言開發，使用GCC編譯器，程序開發IDE工具為Eclipse，開發環境為Linux。使用C語言開發能保證在大數據量的圖像處理工作中，保持比較高的運行效率。本軟件在圖像處理過程中還調用了opencv庫函數。基因判型軟件在Windows環境下使用Visual C++開發。

7 軟件可靠性論證實驗

在本實驗中，分別用批準上市的BE-2.0生物芯片識讀儀(滬食藥監械(準)字2012第2400062號)軟件和本文設計的生物芯片識讀儀軟件對來自臨床實驗室的三種(CYP2C19、MTHFR、ALDH2)顯色型基因芯片產品各200張進行檢測，將檢測結果按照kappa檢驗法[10]分析。分別得到4組kappa系數，以此評價軟件性能的一致性，結果如下：

(1)CYP2C19檢測結果

對于636位點，兩者均檢出的有195例，兩者檢測結果100%相同，其中GG型178例，AG型17例，AA型0例，kappa系數為1。對于681位點[9]，兩者均檢出的有197例，兩者檢測結果100%相同，其中GG型89例，AG型92例，AA型16例，kappa系數為1。

(2)MTHFR檢測結果

兩者均檢出的有188例，兩者檢測結果100%相同，其中CC型49例，CT型89例，TT型50例，kappa系數為1。

(3)ALDH2檢測結果

兩者均檢出的有190例，兩者檢測結果100%相同，其中Glu504Glu型129例，Glu504Lys型55例，TT型6例，kappa系數為1。

表1是二者檢出率的比較。本研究設計的軟件檢出率略優于已上市產品BE-2.0生物芯片識讀儀軟件。判型的準確性從側面論證本軟件的信號點識別定位以及讀值準確性，因此，本研究設計的軟件是可靠的。

表1 檢出率對比

8 結論

本軟件系統分為嵌入式圖像分析軟件和PC端判型軟件，嵌入式軟件通過讀取條碼信息實現了在識讀儀掃描過程中自動輸出相關數據，PC端軟件通過調取掃描數據直接輸出檢測結果。這一配套軟件數據輸出準確，使用方便，分析效率高，可在以玻璃材質為載體的顯色生物芯片識讀儀上推廣使用，并為顯色生物芯片圖像分析軟件設計提供思路。