玉米ZmSUT4基因RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建

弓雪　姜敏　齊欣

摘要：蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）是蔗糖裝載、卸載、分配的重要載體，ZmSUT4是玉米低親和、高轉(zhuǎn)運(yùn)能力SUT4亞族的唯一成員。以黃早四ZmSUT4全長cDNA序列為模板，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特異性引物，PCR擴(kuò)增獲得正向、反向2個(gè)片段，將反向、正向片段雙酶切后依次插入pGreen-HY104植物表達(dá)載體中，從而構(gòu)建由35S啟動(dòng)子調(diào)控的ZmSUT4基因RNA干擾（RNAi）的植物表達(dá)載體HY104-A-S，然后通過凍融法將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pSoup質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105中。ZmSUT4基因RNAi的植物表達(dá)載體的構(gòu)建為研究ZmSUT4基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米；ZmSUT4基因；RNAi植物表達(dá)；載體構(gòu)建

中圖分類號(hào)：S513.03；Q782 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0042-03

玉米的籽粒產(chǎn)量主要取決于籽粒形成過程中成熟葉片（源）光合產(chǎn)物的生產(chǎn)、韌皮部的運(yùn)輸（流）以及在籽粒（庫）中的積累。光合產(chǎn)物的分配運(yùn)輸是植物體內(nèi)源、流、庫相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，源足、庫大、流暢是高產(chǎn)的基礎(chǔ)[1-2]。目前對(duì)源、庫的特性研究較多，但是由于受研究方法和條件等限制，如對(duì)DNA序列了解的限制，對(duì)流的了解還相當(dāng)不足。研究發(fā)現(xiàn)，隨著種植密度增加，收獲指數(shù)快速下降，表明在較高密度條件下，流對(duì)產(chǎn)量的限制作用在增加[3]。流包括韌皮部的裝載、篩管中運(yùn)輸、韌皮部卸出和同化物的重新吸收。蔗糖作為高等植物光合同化物運(yùn)輸?shù)闹饕问剑彩锹?lián)系源庫之間主要的糖類[4]。細(xì)胞膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）承擔(dān)著蔗糖從源細(xì)胞的外運(yùn)、韌皮部的裝載和卸載，以及向庫細(xì)胞的裝入功能，從而影響蔗糖的運(yùn)輸方向、速率和分配，其基因表達(dá)受多種環(huán)境因子的調(diào)控。ZmSUT4是玉米體內(nèi)唯一的高蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力SUT4亞族成員，在植物體內(nèi)的蔗糖運(yùn)輸和分配過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。但是，關(guān)于玉米SUT4的研究才剛剛起步，李志鵬僅利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)ZmSUT4在玉米籽粒灌漿期花柄、籽粒等庫器官的表達(dá)情況，未構(gòu)建RNA干擾載體，分析ZmSUT4表達(dá)被抑制對(duì)植株生長發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)的影響[5]。本研究利用ZmSUT4基因的全長cDNA序列，構(gòu)建ZmSUT4基因RNA干擾載體，為進(jìn)一步研究ZmSUT4基因的生理效應(yīng)及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為研究其他SUTs基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用玉米材料為玉米優(yōu)良自交系黃早四。

KAPA Hifi高保真DNA聚合酶，購自美國KAPA Biosystems公司；T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司；植物總RNA提取試劑盒、Quantscript RT Kit（cDNA第1鏈合成試劑盒）、質(zhì)粒小提試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自北京TIANGEN公司；pEASY-T、大腸桿菌DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA marker DL2000，購自TaKaRa公司。引物合成和測(cè)序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。Taq酶、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。植物表達(dá)載體pGreen-HY104質(zhì)粒及含有pSoup質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105，均由國家玉米改良中心徐明良實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米ZmSUT4基因cDNA序列的獲得 利用植物總RNA提取試劑盒提取黃早四幼苗總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得黃早四全長cDNA序列。

1.2.2 干擾片段的選擇及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已發(fā)表的玉米ZmSUT4基因的全長cDNA序列，選擇該序列上的特異片段及表達(dá)載體pGreen-HY104的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物。分別在5′端加上PstⅠ-EcoRⅠ、BamHⅠ-XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列為：F：5′-GCTGCAGAATTCGTCTGGAAACTCTTTGTGGGT-3′；R：5′-CGGATCCTCGAGCTCCTGTAACTTTTATTCATTGCT-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段長度為219 bp。

1.2.3 干擾片段的擴(kuò)增 以全長cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：熱啟動(dòng)；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，無非特異性條帶，則直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 RNA干擾（RNAi）植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物連接到T載體，獲得T-ZmSUT4，將T-ZmSUT4轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于37 ℃暗培養(yǎng)12～16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑取白色單菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)，將含有目標(biāo)克隆的單菌落于 37 ℃ 搖菌過夜，送公司測(cè)序。提取包含正確序列T載體的質(zhì)粒，用XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切表達(dá)載體pGreen-HY104、T-ZmSUT4質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物；用T4-DNA連接酶過夜連接，將干擾片段反向插入表達(dá)載體中，得到HY104-A，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Kan抗性篩選目標(biāo)克隆，提取質(zhì)粒驗(yàn)證；用BamHⅠ、PstⅠ酶切載體HY104-A、T-ZmSUT4，回收酶切產(chǎn)物，過夜連接得到HY104-A-S（圖1），轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Kan抗性篩選目標(biāo)克隆，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 采用凍融

法[6]將構(gòu)建好的RNAi植物表達(dá)載體HY104-A-S轉(zhuǎn)化含有pSoup質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有Rif（50 μg/mL）、Kan（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)2 d。挑取陽性菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 干擾片段的PCR擴(kuò)增

以玉米ZmSUT4基因的cDNA序列為模板，利用攜帶酶切位點(diǎn)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖2可知，本試驗(yàn)得到219 bp的片段。將該片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落經(jīng)PCR鑒定后，將陽性克隆送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與黃早四cDNA序列完全一致（圖3）。

2.2 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

提取T-ZmSUT4、pGreen-HY104載體的質(zhì)粒，用 XhoⅠ、EcoRⅠ對(duì)2種質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖4，膠回收連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，Kan抗性篩選目標(biāo)克隆，對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定。提取正確克隆的質(zhì)粒HY104-A，利用BamHⅠ、PstⅠ酶切載體HY104-A、T-ZmSUT4，結(jié)果見圖5?；厥彰盖挟a(chǎn)物，連接后得到HY104-A-S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，Kan抗性篩選目標(biāo)克隆，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，利用EcoRⅠ酶切該質(zhì)粒，預(yù)測(cè)應(yīng)得到約1 000 bp的小片段。圖6電泳結(jié)果與預(yù)期一致，表明植物表達(dá)載體HY104-A-S構(gòu)建正確。

2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌

分別以陽性對(duì)照質(zhì)粒HY104-A-S和含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌落為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明：含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液所得條帶正確（圖7），表明HY104-A-S載體質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入含pSoup質(zhì)粒農(nóng)桿菌EHA105中。

3 討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指內(nèi)源或外源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）高效特異性降解與

其高度同源的mRNA，有效地阻斷目的基因的表達(dá)，從而獲得功能缺失的突變體，因此該技術(shù)可作為研究基因組功能、創(chuàng)造分子育種新材料的有效手段。目前，RNA干擾技術(shù)已在玉米、水稻、大麥、小麥、大豆和馬鈴薯等作物中成功應(yīng)用[7-13]。Wesley等研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA的長度影響目的基因的沉默效率，干擾片段長度在98～853 bp之間時(shí)基因沉默效率較高[14-15]。此外，在插入的正向與反向干擾片段之間應(yīng)有適當(dāng)長度的間隔序列，以便RNAi表達(dá)載體在轉(zhuǎn)入玉米后形成含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dsRNA，進(jìn)而干擾ZmSUT4基因的表達(dá)。

Chincinska等利用RNA干擾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，馬鈴薯StSUT4-RNAi植株源葉中蔗糖輸出增加，促使蔗糖、淀粉在塊莖等庫器官大量積累，進(jìn)而引起塊莖產(chǎn)量增加[16-17]。本研究成功構(gòu)建了玉米ZmSUT4基因的RNAi植物表達(dá)載體，不但為探究ZmSUT4基因表達(dá)在源庫互作中的功能奠定了基礎(chǔ)，還為進(jìn)一步研究蔗糖運(yùn)輸、分配的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)，也為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)節(jié)蔗糖的運(yùn)輸、分配，從而提高玉米籽粒產(chǎn)量提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]王文靜. 不同穗型冬小麥籽粒灌漿期源庫強(qiáng)度及其與淀粉積累的關(guān)系[J]. 作物學(xué)報(bào)，2004，30（9）：916-921.

[2]王玲玲，杜吉到，鄭殿峰，等. 大豆源庫流關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 大豆科學(xué)，2009，28（1）：167-171.

[3]關(guān)義新，凌碧瑩，林 葆，等. 高產(chǎn)春玉米群體庫及源庫流的綜合調(diào)控[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31（6）：537-540.

[4]Saint Pierre C，Peterson C J，Ross A S，et al. Winter wheat genotypes under different levels of nitrogen and water stress：changes in grain protein 40 composition[J]. Journal of Cereal Science，2008，47（3）：407-416.

[5]李志鵬. 玉米蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體（ZmSUT2和ZmSUT4）的基因克隆及其功能鑒定[D]. 北京：北京師范大學(xué)，2006：45-50.

[6]Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：19-22.

[7]Cigan A M，Unger-Wallace E，Haug-Collet K. Transcriptional gene silencing as a tool for uncovering gene function in maize[J]. The Plant Journal，2005，43（6）：929-940.

[8]Miki D，Itoh R，Shimamoto K. RNA silencing of single and multiple members in a gene family of rice[J]. Plant Physiology，2005，138（4）：1903-1913.

[9]Gil-Humanes J，Pistón F，Hernando A，et al. Silencing of γ-gliadins by RNA interference （RNAi） in bread wheat[J]. Journal of Cereal Science，2008，48：565-568.

[10]Kasai M，Kanazawa A. RNA silencing as a tool to uncover gene function and engineer novel traits in soybean[J]. Breeding Science，2012，61（5）：468-479.

[11]周曉嬰，付三雄，陳搖松，等. 甘藍(lán)型油菜CRABSCLAW基因克隆及其RNA干擾載體的構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（4）：737-742.

[12]楊瑪麗，趙統(tǒng)敏，余文貴，等. 轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)在番茄研究中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（1）：217-221.

[13]楊瑪麗，張保龍，郭佳茹，等. RNAi和GroEL介導(dǎo)的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TYLCV的抗性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：1102-1108.

[14]Wesley S V，Liu Q，Wielopolska A，et al. Custom knock-outs with hairpin RNA-mediated gene silencing[J]. Methods in Molecular Biology，2003，236：273-286.

[15]Wesley S V，Helliwell C A，Smith N A，et al. Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. The Plant Journal，2001，27（6）：581-590.

[16]Chincinska I A，Liesche J，Krügel U，et al. Sucrose transporter StSUT4 from potato affects flowering，tuberization，and shade avoidance response[J]. Plant Physiology，2008，146（2）：515-528.

[17]Chincinska I，Gier K，Krügel U，et al. Photoperiodic regulation of the sucrose transporter StSUT4 affects the expression of circadian-regulated genes and ethylene production[J]. Frontiers in Plant Science，2013，4（2）：26.