矮冷水花成分預(yù)試驗(yàn)及不同溶劑提取物的抗氧化活性

曹劍鋒　任朝輝　蘆靜波

摘要：通過(guò)對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、·OH的清除活性、還原力、螯合能力、總抗氧化能力的測(cè)定，評(píng)價(jià)矮冷水花水提取物、95%乙醇提取物及其石油醚相、乙酸乙酯相和水溶性3個(gè)不同極性部位的抗氧化活性；測(cè)定總黃酮、總酚含量；采用化學(xué)反應(yīng)鑒別法對(duì)矮冷水花提取物進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明：矮冷水花可能含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油或油脂、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖、苷類(lèi)、甾體、萜類(lèi)內(nèi)酯、香豆素及其苷類(lèi)化學(xué)成分。試驗(yàn)結(jié)果表明：水提取物、95%乙醇提取物以及其石油醚相、乙酸乙酯相、水溶性部位提取物均表現(xiàn)出一定抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的黃酮、總酚含量最高，分別為28.43%、2.16%，清除DPPH自由基、·OH的能力、還原力、螯合力及總抗氧化能力的IC50值分別為0.142、0.598、0.328、1.008、0.298 mg/mL，并且隨著濃度的增加，清除活性增強(qiáng)。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，矮冷水花提取物具有很好的抗氧化活性，乙酸乙酯部位抗氧化活性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：矮冷水花；化學(xué)成分；提取物；抗氧化活性；藥用價(jià)值

中圖分類(lèi)號(hào)： S132 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0307-05

矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]屬蕁麻科，為一年生草本，別稱(chēng)地油仔、苔水花。矮冷水花分布于我國(guó)華東、西南等地，常被作為蔬菜食用，因具有清熱解毒、祛痰止痛、消炎、褪腫、通便、利尿等功效，民間用于清熱解毒祛瘀止痛、跌打損傷、無(wú)名腫毒、毒蛇咬傷、瘡癤等癥[1]。陳謝生等研究矮冷水花并制成了適合防治多種毒蛇的蛇傷草藥[2]；張浩等對(duì)矮冷水花進(jìn)行了生藥學(xué)鑒定研究[3]。有關(guān)矮冷水花的研究報(bào)道較少，本研究對(duì)矮冷水花的化學(xué)成分和對(duì)水提物、乙醇提取物不同萃取物抗氧化活性進(jìn)行初步研究，以期為矮冷水花植物藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

矮冷水花，采自貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)，經(jīng)貴州師范學(xué)院朱富壽教授鑒定為蕁麻科植物矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]。

1.2 主要藥品及試劑

石油醚、乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、茚三酮、三氯化鐵、溴甲酚綠、乙酸、碘化汞鉀、碘、碘化鉍鉀、硅鎢酸、堿性苦味酸、3，5-二硝基苯甲酸、氫氧化鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水楊酸、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、菲咯嗪（ferrozine）、硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、蕓香苷、亞硝酸鈉、硝酸鋁、沒(méi)食子酸、碳酸鈉等，均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器

722分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海梅香儀器有限公司。

1.4 不同提取物的制備

1.4.1 水提物的制備 稱(chēng)取100 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸餾水，浸泡24h，然后于40 ℃ 超聲2 h，過(guò)濾、濃縮凍干，即得水提物，冷藏備用。

1.4.2 乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水溶性提取物的制備 稱(chēng)取500 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入乙醇（95%），不時(shí)振蕩，浸泡24 h；然后于40 ℃超聲2h，過(guò)濾，從濾液中回收乙醇至無(wú)醇味；取1/4量濃縮液作為乙醇提取物，濃縮凍干，冷藏備用；剩余3/4濃縮液先用石油醚萃取3次，過(guò)濾，回收石油醚，濃縮凍干，即得到石油醚提取物，冷藏備用。取上述剩余的濃縮液，加入500 mL 5%鹽酸，充分?jǐn)嚢琛⑦^(guò)濾，將過(guò)濾部分做酸水試驗(yàn)。酸水不溶部分加500 mL乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯液用 500 mL 5%NaOH溶液振搖洗滌2次，棄去堿水層；乙酸乙酯層再用蒸餾水洗2次，至水洗液呈中性反應(yīng)，棄去水洗液，回收乙酸乙酯，濃縮凍干，即得乙酸乙酯提取物，不溶于乙酸乙酯的部分為水溶性提取物，將其冷藏備用。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn) （1）用石油醚提取物分別做揮發(fā)油、油脂、甾體的預(yù)試驗(yàn)，方法見(jiàn)表1。（2）用乙醇、乙酸乙酯提取物做酚類(lèi)、鞣質(zhì)、植物甾體、三萜類(lèi)、蒽醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、香豆素與內(nèi)脂、強(qiáng)心苷等預(yù)試驗(yàn)，方法見(jiàn)表2、表3。（3）用酸水提取物做生物堿預(yù)試驗(yàn)，方法見(jiàn)表4。（4）用水提取物做氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖、多糖、苷類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、皂苷等預(yù)試驗(yàn)，方法見(jiàn)表5。

1.5.2 黃酮含量的測(cè)定 取100 μL樣品原液于試管中，加30%乙醇補(bǔ)齊到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻；放置6 min 后，再加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液；加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min后，在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度[4]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。精確配制濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品蕓香苷的標(biāo)準(zhǔn)液，分別精確吸取0、1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)液于6支具塞試管中，加30%乙醇補(bǔ)齊到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻；放置6 min后，再加入4 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液；加0.4 mL蒸餾水，搖勻，放置10～15 min后，在515 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

y=0.270 8x-0.001 5，r2=0.990 1。

式中：y為吸光度D515 nm；x為蕓香苷濃度，mg/mL。

1.5.3 總酚含量的測(cè)定 取100 μL原液樣品于試管中，加水補(bǔ)齊到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，振蕩20 s后反應(yīng)5 min；再加入2 mL7.5%碳酸鈉溶液，振蕩20 s后反應(yīng)1 h，于760 nm測(cè)定吸光度D760 nm[5]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。配制濃度為100 μg/mL的沒(méi)食子酸溶液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，共6支試管，加水補(bǔ)齊到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu試劑，振蕩20 s后反應(yīng)5 min；再加入2 mL7.5%碳酸鈉溶液，振蕩20 s后反應(yīng)1 h，在760 nm處測(cè)定吸光度D760 nm。空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

y=34.799x+0.002 2，r2=0.999 1。

式中：y為吸收光度D760 nm；x為沒(méi)食子酸濃度，mg/mL。

1.5.4 不同部位的抗氧化活性測(cè)定 （1）DPPH·清除活性。以95%乙醇為溶劑，配制濃度0.2 mmol/L的DPPH·溶液。加樣品后于試管中補(bǔ)齊至1 mL，加入1 mL DPPH溶液，使總體積為2 mL，搖勻。室溫放置30 min后記錄517 nm處吸光度D517 nm（樣品）[6-7]；向1 mL DPPH·溶液中加入1 mL蒸餾水，記錄吸光度D517 nm（空白），即為空白對(duì)照；以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品DPPH·清除率：

DPPH·清除率=（D517 nm（空白）-D517 nm（樣品））/D517 nm（空白）×100%。

（2）·OH清除活性。分別在試管中加入1 mL 3 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1 mL 005%過(guò)氧化氫溶液，立即混勻，然后加入不同體積的樣品溶液并補(bǔ)齊至1 mL。以等體積的蒸餾水作為空白對(duì)照，于 37 ℃ 反應(yīng)30 min，在510 nm下測(cè)量吸光度D510 nm（樣品）、D510 nm（空白）[8]。以1 mL 3 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2 mL蒸餾水作為本底吸收（調(diào)零管）。相應(yīng)公式為：

清除率=（D510 nm（空白）-D510 nm（樣品））/D510 nm（空白）×100%。

（3）還原力測(cè)定。加入不同體積的樣品后補(bǔ)齊至1 mL，再加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液和25 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min；加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min；取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL三氯化鐵（0.1%），于700 nm 處測(cè)定吸光度D700 nm[9-10]，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

（4）螯合能力測(cè)定。加入不同體積的樣品后補(bǔ)齊至 1 mL，再加入3.7 mL蒸餾水、0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵（FeCl2）溶液，振蕩30 s，混合均勻；然后加入0.2 mL 0.5 mmol/L ferrozine啟動(dòng)反應(yīng)，室溫放置30 min；接下來(lái)于3 000 r/min 離心 5 min，取上清液在562 nm處測(cè)定吸光度D562 nm，以EDTA為對(duì)照[11]。

（5）總抗氧化能力的測(cè)定。加入不同體積的樣品后補(bǔ)齊至1、4 mL，試劑中含0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨，混勻后于95 ℃水浴中恒溫90 min，在695 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度D695 nm。空白用1 mL蒸餾水代替樣品液，以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照[12]。

1.5.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行t檢測(cè)處理 。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

石油醚提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、酸水提取物、水提取物化學(xué)鑒別試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1至表5。

2.2 矮冷水花不同提取物黃酮、酚類(lèi)含量

由表6可以看出：矮冷水花乙酸乙酯提取物的總黃酮含量最高，為28.43%；其次是乙醇提取物中的含量，為2176%；水溶性、水提取物中黃酮含量分別為1.83%、192%。因此，矮冷水花黃酮主要集中在乙酸乙酯、乙醇部分，矮冷水花乙酸乙酯提取物的總酚含量為2.16%，含量最高；乙醇提取物、水溶性、水提取物總酚含量分別為077%，0.59%、0.27%，因此可知，矮冷水花總酚含量主要集中在乙酸乙酯部分，其次是乙醇部分。

2.3 DPPH· 清除活性

從圖1可以看出，矮冷水花不同提取物對(duì)DPPH·均具有一定的清除作用，且隨著提取物濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)；在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH·清除活性可達(dá)到97.0%，高于同濃度乙醇提取物的76.2%、水溶性部分的53.7%，以及水提物的7.4%。因此可知，矮冷水花乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH·清除活性最強(qiáng)。

2.4 ·OH清除活性

從圖2可以看出，矮冷水花不同提取物對(duì)·OH均具有一定的清除作用，且隨著提取物濃度的增加，清除活性逐漸增強(qiáng)。在濃度為1.5 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)·OH清除活性可達(dá)到99.9%，同濃度的水提物、乙醇提取物、水溶性部分的清除率分別為94.8%、73.2%、67.7%。因此矮冷水花乙酸乙酯提取物對(duì)·OH自由基清除活性最強(qiáng)，其次為水提取物部位。

2.5 還原力測(cè)定

從圖3可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的還原能力，且隨著提取物濃度的增加，還原能力逐漸增強(qiáng)。在濃度為1 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物還原能力D700 nm為1.31，同濃度的乙醇提取物、水溶性部分、水提物D700 nm分別為0.78、0.39、0.19。因此，矮冷水花乙酸乙酯提取物的還原能力最強(qiáng)。

2.6 螯合能力測(cè)定

從圖4可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的螯合能力，且隨著提取物濃度的增加，螯合能力逐漸增強(qiáng)。在濃度為1.2 mg/mL時(shí)，水提取物螯合能力D562 nm為0.87，同濃度的乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶性部分的D562 nm分別為0.53、0.52、0.16。因此可知：矮冷水花水提取物的螯合能力最強(qiáng)，乙酸乙酯提取物次之。

2.7 總抗氧化能力的測(cè)定

從圖5可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的總抗氧化能力，且隨著提取物濃度的增加，總抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。在濃度為1.2 mg/mL時(shí)，乙酸乙酯提取物總抗氧化能力D695 nm為1.35，高于同濃度的乙醇提取物的0.52；水溶性提取物的D695 nm為0.13，明顯高于水提物的0.01。因此可知，矮冷水花水提取物的總抗氧化能力最強(qiáng)，主要集中在乙酸乙酯、乙醇提取物部位。

2.8 矮冷水花不同提取物抗氧化IC50值

由表7可見(jiàn)，在4個(gè)不同提取物中，清除DPPH·能力、還原力、總抗氧化能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，其中乙酸乙酯提取物清除DPPH·的活性約為維生素C的1/10，乙醇提取物約為維生素C的1/20左右； 清除·OH自由基活性能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>水提物>乙醇提取物>水溶性，水提物表現(xiàn)較強(qiáng)的清除·OH活性，其活性約為純品維生素C的1/6；螯合能力大小依次是：水提物>乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性。3 結(jié)論

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果初步表明：矮冷水花中可能含有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、香豆素類(lèi)、揮發(fā)油、植物甾醇、糖類(lèi)、苷類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等化學(xué)成分。本研究初步確定了矮冷水花可能存在的化學(xué)成分， 為矮冷水花活性成分的提取、分離、純化和篩選研究提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究表明，植物提取物的抗氧化活性與植物中多酚、黃酮含量密切相關(guān)[13-16]。通過(guò)對(duì)比冷水花抗氧化活性與總黃酮、總酚含量可知，矮冷水花提取物不同極性部位黃酮、總酚含量大小依次為：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物。體外抗氧化研究結(jié)果表明：4種提取物對(duì)DPPH·清除力、還原力、螯合力、總抗氧化力均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，次序是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，對(duì)DPPH·表現(xiàn)出中等極性乙酸乙酯的活性較強(qiáng)，極性大的水部位相對(duì)較弱，但對(duì)羥自由基清除能力方面，水提取物明顯較強(qiáng)。總之，本試驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物部位是矮冷水花抗氧化活性的主要部位，提示黃酮、多酚類(lèi)化合物是矮冷水花抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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