茄堿通過調控Stat3信號通路影響胰腺癌細胞Panc-1中MMP-2和MMP-9表達

吳素娜，劉樂偉，黃智銘

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·論著 基礎研究·

茄堿通過調控Stat3信號通路影響胰腺癌細胞Panc-1中MMP-2和MMP-9表達

吳素娜1，劉樂偉1，黃智銘2

（1.溫州醫科大學附屬樂清市人民醫院 消化內鏡科，浙江 溫州 325600；2.溫州醫科大學附屬第一醫院消化內科，浙江 溫州 325000）

目的 探討茄堿對胰腺癌細胞Panc-1中基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達的影響及Stat3信號通路在此過程中的作用。方法 實驗分為對照組和藥物組，藥物組分別采用濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L的茄堿對Panc-1細胞進行干預，明膠酶譜法觀察茄堿對細胞中MMP-2和MMP-9活性的影響；實時熒光定量PCR檢測MMP-2和MMP-9基因的表達變化；Western blotting法檢測總蛋白中信號轉導及轉錄激活因子3（Stat3）蛋白的磷酸化表達變化。結果 與對照組相比，藥物組（7.0、10.5 μmol/L）MMP-2活性明顯下降（t值分別為2.4、6.4，P＜0.05）；MMP-9活性亦下降（t值分別為3.2、4.8，P＜0.05）。實時熒光定量PCR結果顯示，藥物組（7.0 μmol/L、10.5 μmol/L）MMP-2基因表達下調（t值分別為8.7、13，P＜0.05）；MMP-9基因表達下調（t值分別為3.2、16.3，P＜0.05）。Western blotting結果顯示，隨著茄堿濃度的增加，Panc-1細胞中Stat3蛋白磷酸化受到明顯抑制（t值分別為10.2、6.4、6.2，P＜0.05），延長藥物處理的時間（12 h、18 h、24 h）亦可抑制Stat3蛋白磷酸化（t值分別為11.4、26.1、20.4，P＜0.05）。結論 茄堿可抑制胰腺癌細胞Panc-1中MMP-2和MMP-9的表達，發揮其抗腫瘤轉移能力。其具體機制可能與調控Sata3信號通路有關。

茄堿；胰腺癌；基質金屬蛋白酶；轉移；Stat3通路

胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，其年病死率幾乎等于其發病率。世界范圍內，胰腺癌在引起男性和女性因癌癥死亡的原因中分別排名第8位和第9位［1］。在中國，僅有8％～10％的胰腺癌患者能在確診后的1年存活，平均存活期為4～5個月［2］，98％～99％的患者會在5年之內死亡。如此差的預后與胰腺癌本身臨床表現的隱匿性與其高轉移能力有直接關系，因此，提高胰腺癌早期診斷及遏制其強轉移性，對于患者預后的提高有重要意義。現階段，發現新的治療藥物，特別是中草藥物，以提高胰腺癌的預后水平，已成為近年來研究熱點。茄堿（Solanine）是馬鈴薯中一種主要的甾體類生物堿［3］，可抑制人肝癌、胃癌等細胞的增殖［4］，亦可促進癌細胞的凋亡［5］。腫瘤細胞可分泌基質金屬蛋白酶（MMPs），MMPs可水解基底膜和細胞外基質，從而促進腫瘤細胞發生轉移。MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族中成員，它們在腫瘤轉移進程中發揮重要作用［6-7］。Stat3是Stat家族中重要成員，其在Tyr705位點被激活后，形成p-Stat3，其二聚體進入細胞核，調控靶基因轉錄。研究發現，在正常細胞中，Stat的激活是短暫的，而在大多數原發腫瘤和癌細胞株中Stat蛋白（尤其是Stat3）通過酪氨酸激酶持續性的激活和（或）脫磷酸化的負調節蛋白的減少而保持活性［8］。大量研究證實，活化的Stat3可調控腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、腫瘤侵襲及血管形成等參與腫瘤進展。有研究指出，p-Stat3表達與結直腸癌標本，且其表達與腫瘤浸潤度、淋巴結轉移及Dukes分期相關，表明Stat3的活化參與結直腸癌的侵襲轉移［9］。國內亦有研究發現，在胰腺癌組織中存在p-Stat3高表達，通過雙變量相關分析進一步證實p-Stat3與MMP-2和MMP-9正相關，提示p-Stat3可能通過上調MMP-2和MMP-9的表達促進胰腺癌的侵襲轉移［10］。本研究主要通過應用茄堿體外處理胰腺癌細胞株Panc-1，觀察其對細胞MMP-2和MMP-9表達的影響，揭示其是否能夠發揮抗腫瘤轉移能力，并探討Stat3通路在其中發揮的作用。

1 材料和方法

1.1藥品與試劑

人胰腺癌細胞株Panc-1，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；茄堿，美國Sigma公司，用二甲亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解至50 μg/mL，用培養液稀釋至工作濃度。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM均為Gibco公司產品；Stat3、p-Stat3等兔抗，美國ABCAM公司；辣根過氧化物酶標記的二抗，美國Bioworld公司；其余試劑均有為國產分析純。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養：人胰腺癌細胞Panc-1用含10％胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5％ CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞用于實驗研究，分為對照組（不用藥物處理）和藥物組（加入茄堿，使終濃度為3.5、7.0和10.5 μmol/L）。

1.2.2PANC-1細胞中MMP-2和MMP-9的活性檢測：采用明膠酶譜法。藥物處理PANC-1細胞24 h后收集各組上清液離心備用。各組上清液經蛋白定量后，依次取等量蛋白的上清液4 ℃進行SDS-PAGE電泳100 V約1.5 h，洗脫液振蕩邊洗脫2次，每次40 min，漂洗液漂洗2次，每次20 min；接著把凝膠放在孵育液中37 ℃孵育42 h，孵育完成后用染色液染色3 h，及脫色液A、B、C分別脫色0.5 h、1 h、2 h后，有MMP-2（72 KD）和MMP-9（92 KD）在藍色背景上的條帶，分析條帶灰度值，做統計學分析。

1.2.3MMP-2和MMP-9 mRNA檢測：采用實時熒光定量PCR法。藥物處理PANC-1胰腺癌細胞24 h后，TRIZOL提取細胞總RNA，經純度濃度檢測后，進行逆轉錄反應，反應的條件：37 ℃、15 min→98 ℃、5 min。反應完成后將cDNA用RNase-free水稀釋5倍，置于-20 ℃保存。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒配置反應體系在ABI 7500 Realtime PCR儀上進行PCR反應，反應條件為：95 ℃、10 min→（95 ℃、15 s→60 ℃、60 s）×40。反應結束后確認反應的擴增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCT方法，算出相對值，以對照組的相對倍數的形式表示。引物序列（5'-3'）：MMP-2，上游：AATGCCATCCCCG ATAACC，下游：GCTCAGCAGCCTAGCCAGTC；MMP-9上游：GGGGGAAGATGCTGCTGTT，下游：AGCGGTCCTGGCAGAAA TAG；GAPDH上游：GGGTGTGAACCATGAGAAGTATG，下游：GATGGCATGGACTGTGGTCAT。

1.2.4目的蛋白的表達檢測：采用Western blotting法。細胞經不同濃度茄堿處理后，冷PBS洗3次，RIPA裂解液裂解細胞收集蛋白。進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育Stat3、p-Stat3等抗體（1∶1 000）4 ℃過夜，TBST洗滌后與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫搖床1 h，ECL顯色。用10.5 μmol/L茄堿處理細胞，分別在6、12、18、24 h收集細胞蛋白，處理方法同上。用Quantity one軟件分析灰度值。

1.3統計學分析

2 結果

2.1茄堿對MMP-2和MMP-9活性的影響

不同濃度（3.5、7.0和10.5 μmol/L）的茄堿處理細胞24 h后，各組細胞MMP-2和MMP-9活性見圖1、表1。

2.2茄堿對MMP-2和MMP-9 mRNA表達的影響

不同濃度的茄堿處理細胞24 h后，各組細胞MMP-2和MMP-9 mRNA表達見表2、圖2。

圖1　MMP-2和MMP-9活性變化

表1　不同濃度茄堿處理24 h后Panc-1細胞中MMP-2和MMP-9活性相對值

圖2　MMP-2和MMP-9 mRNA表達變化

2.3茄堿對Stat3蛋白磷酸化表達的影響

Western blotting結果顯示，細胞總蛋白中藥物組p-Stat3表達明顯低于對照組。細胞經不同濃度藥物處理后p-Stat3表達與對照組相比降低，t值分別為10.2，6.4，6.2，P＜0.05，隨著處理時間增加（12 h、18 h、24 h），p-Stat3表達與對照組相比亦降低，t值分別為11.4，26.1，20.4，P＜0.05。該結果提示茄堿可阻止Stat3的磷酸化進程。見圖3。

3 討論

表2　不同濃度茄堿處理24 h后Panc-1細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA相對表達值

茄堿廣泛存在于馬鈴薯、番茄及茄子等茄科植物中。有研究表明，茄堿具有明顯的抗腫瘤作用，其可抑制多種腫瘤細胞系的生長增殖［11］，促進細胞內Ca2+釋放，抑制BCL-2的表達，啟動線粒體凋亡途徑誘導腫瘤細胞的凋亡［12-14］。本研究中，我們通過明膠酶譜法及PCR法研究了茄堿對Panc-1細胞中MMP-2和MMP-9的活性及轉錄表達的影響，以進一步驗證其潛在的抗腫瘤特性。

因茄堿本身具有毒性，課題組前期已通過CCK8實驗篩選出茄堿對細胞不產生毒性的各藥物濃度及時間點，在本文中所采用的藥物濃度及時間下，茄堿對細胞活性無影響，在此前提下，研究茄堿所發揮的抗腫瘤作用。我們在明膠酶譜實驗中發現，經茄堿（7.0 μmol/L、10.5 μmol/L）處理細胞24 h后，MMP-2的表達活性明顯低于對照組（t值分別為2.4、6.4，P＜0.05），MMP-9的表達亦表現出相似結果（t值分別為3.2、4.8，P＜0.05）。在RT-PCR實驗中，我們進一步證實了茄堿可以在mRNA水平抑制MMP-2和MMP-9的表達（t值分別為8.7、13，P＜0.05；t值分別為3.2、16.3，P＜0.05），結果提示茄堿可以削弱胰腺癌細胞的遠處轉移能力。在本研究中，我們通過Western blotting實驗發現，經不同濃度茄堿處理細胞后，p-Stat3的表達均明顯下降（t值分別為10.2、6.4、6.2，P＜0.05），并且隨著藥物作用時間的延長，p-Stat3表達亦表現出下降趨勢（t值分別為11.4、26.1、20.4，P＜0.05）。數據揭示了p-Stat3與MMP-2和MMP-9正相關，在一定程度上提示p-Stat3可能參與上調MMP-2和MMP-9的表達，進而促進胰腺癌的遠處轉移。

圖3　不同濃度（A、C）和不同時間（B、D）茄堿處理對Stat3及p-Stat3蛋白表達的影響

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（本文編輯：魯翠濤）

Solanine effects the expression of MMP-2 and MMP-9 in PANC-1 by regulating Stat3 pathway

WU Su-na1， LIU Le-wei1， HUANG Zhi-ming2.1Department of Digestive Endoscopy， The People’s Hospital of Yueqing， Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325600；2Department of Gastroenterology， The First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000

Objective To investigate the effects of Solanine on MMP-2 and MMP-9 in pancreatic cancer cell line Panc-1 and to explore the involved function of Stat3 pathway. Methods The experiment was divided into Control group and Solanine group. In Solanine group， Panc-1 cells were treated with various concentrations of Solanine （3.5， 7.0 and 10.5 μmol/L）. Activities of MMP-2 and MMP-9 were analyzed by Gelatin Zymography. A quantitative analysis of MMP-2 and MMP-9 mRNA expression was performed by using Real-time PCR. The protein expression of p-Stat3 were evaluated with Western blotting. Results Compared with the Control group，Solanine group （7.0 μmol/L， 10.5 μmol/L） significantly inhibited activities of MMP-2 in Panc-1 cells （t=2.4，6.4， P＜0.05）， as well as the MMP-9 activities （t=3.2， 4.8， P＜0.05）. The mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 showed the same results （t=8.7， 13， P＜0.05； t=3.2， 16.3， P＜0.05）. The protein expression of p-Stat3 was depressed by Solanine in a dose- and time- dependent manner （t=10.2， 6.4， 6.2， P＜0.05； t=11.4， 26.1， 20.4， P＜0.05）. Conclusion Solanine may possess anti-metastasis efficacy by inhibiting the expression of MMP-2 and MMP-9 in Panc-1 cells at least in part via Stat3 signaling pathways.

Solanine； pancreatic cancer； matrix metalloproteinases （MMPs）； metastasis； Stat3 pathway

R735.9

A DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.05.013

2016-01-04

吳素娜（1984-），女，浙江溫州人，主治醫師。

簡介］黃智銘，主任醫師，教授，E-mail：wyyyhzhiming@126.com。